Per significativamentecontrollo delle zanzarePer ridurre l'incidenza delle malattie che trasmettono, sono necessarie alternative strategiche, sostenibili ed ecocompatibili ai pesticidi chimici. Abbiamo valutato le farine di semi di alcune Brassicaceae (famiglia Brassica) come fonte di isotiocianati di origine vegetale, prodotti mediante idrolisi enzimatica di glucosinolati biologicamente inattivi, da utilizzare nel controllo dell'Aedes egiziana (L., 1762). Cinque farine di semi sgrassati (Brassica juncea (L) Czern., 1859, Lepidium sativum L., 1753, Sinapis alba L., 1753, Thlaspi arvense L., 1753 e Thlaspi arvense – tre principali tipi di inattivazione termica e degradazione enzimatica Prodotti chimici Per determinare la tossicità (LC50) di isotiocianato di allile, isotiocianato di benzile e 4-idrossibenzilisotiocianato sulle larve di Aedes aegypti a 24 ore di esposizione = 0,04 g/120 ml dH2O). Valori di LC50 per senape, senape bianca ed equiseto. La farina di semi era rispettivamente 0,05, 0,08 e 0,05 rispetto all'isotiocianato di allile (LC50 = 19,35 ppm) e 4. -L'idrossibenzilisotiocianato (LC50 = 55,41 ppm) era più tossico per le larve 24 ore dopo il trattamento rispetto a 0,1 g/120 ml dH2O rispettivamente. Questi risultati sono coerenti con la produzione di farina di semi di erba medica. La maggiore efficienza degli esteri benzilici corrisponde ai valori LC50 calcolati. L'uso della farina di semi può fornire un metodo efficace di controllo delle zanzare. l'efficacia della polvere di semi di crucifere e dei suoi principali componenti chimici contro le larve di zanzara e mostra come i composti naturali nella polvere di semi di crucifere possono servire come un promettente larvicida ecocompatibile per il controllo delle zanzare.
Le malattie trasmesse da vettori, come le zanzare Aedes, rappresentano ancora un grave problema di salute pubblica a livello globale. L'incidenza di queste malattie si diffonde geograficamente1,2,3 e si ripresenta, dando luogo a focolai di gravi patologie4,5,6,7. La diffusione di malattie tra esseri umani e animali (ad esempio, chikungunya, dengue, febbre della Rift Valley, febbre gialla e virus Zika) è senza precedenti. La sola dengue mette a rischio di infezione circa 3,6 miliardi di persone nelle zone tropicali, con una stima di 390 milioni di infezioni all'anno, che causano tra i 6.100 e i 24.300 decessi all'anno8. La ricomparsa e l'epidemia del virus Zika in Sud America hanno attirato l'attenzione mondiale a causa dei danni cerebrali che provoca nei bambini nati da donne infette2. Kremer et al.3 prevedono che l'areale geografico delle zanzare Aedes continuerà ad espandersi e che entro il 2050 metà della popolazione mondiale sarà a rischio di infezione da arbovirus trasmessi dalle zanzare.
Ad eccezione dei vaccini recentemente sviluppati contro la dengue e la febbre gialla, non sono ancora stati sviluppati vaccini contro la maggior parte delle malattie trasmesse dalle zanzare9,10,11. I vaccini sono ancora disponibili in quantità limitate e vengono utilizzati solo in studi clinici. Il controllo dei vettori zanzare mediante insetticidi sintetici è stata una strategia chiave per controllare la diffusione delle malattie trasmesse dalle zanzare12,13. Sebbene i pesticidi sintetici siano efficaci nell'uccidere le zanzare, il loro uso continuato influisce negativamente sugli organismi non bersaglio e inquina l'ambiente14,15,16. Ancora più allarmante è la tendenza all'aumento della resistenza delle zanzare agli insetticidi chimici17,18,19. Questi problemi associati ai pesticidi hanno accelerato la ricerca di alternative efficaci ed ecocompatibili per il controllo dei vettori di malattie.
Diverse piante sono state sviluppate come fonti di fitopestici per il controllo dei parassiti20,21. Le sostanze vegetali sono generalmente ecocompatibili perché biodegradabili e presentano una tossicità bassa o trascurabile per gli organismi non bersaglio come mammiferi, pesci e anfibi20,22. È noto che i preparati a base di erbe producono una varietà di composti bioattivi con diversi meccanismi d'azione per controllare efficacemente i diversi stadi vitali delle zanzare23,24,25,26. I composti derivati dalle piante, come gli oli essenziali e altri ingredienti vegetali attivi, hanno attirato l'attenzione e aperto la strada a strumenti innovativi per il controllo dei vettori di zanzare. Oli essenziali, monoterpeni e sesquiterpeni agiscono come repellenti, deterrenti alimentari e ovicidi27,28,29,30,31,32,33. Molti oli vegetali causano la morte di larve, pupe e adulti di zanzara34,35,36, colpendo il sistema nervoso, respiratorio, endocrino e altri importanti sistemi degli insetti37.
Studi recenti hanno fornito informazioni sul potenziale utilizzo delle piante di senape e dei loro semi come fonte di composti bioattivi. La farina di semi di senape è stata testata come biofumigante38,39,40,41 e utilizzata come ammendante del suolo per la soppressione delle erbe infestanti42,43,44 e il controllo di patogeni vegetali presenti nel suolo45,46,47,48,49,50, nematodi 41,51, 52, 53, 54 e parassiti 55, 56, 57, 58, 59, 60. L'attività fungicida di queste polveri di semi è attribuita a composti fitoprotettivi chiamati isotiocianati38,42,60. Nelle piante, questi composti protettivi sono immagazzinati nelle cellule vegetali sotto forma di glucosinolati non bioattivi. Tuttavia, quando le piante vengono danneggiate dall'alimentazione degli insetti o dall'infezione di agenti patogeni, i glucosinolati vengono idrolizzati dalla mirosinasi in isotiocianati bioattivi55,61. Gli isotiocianati sono composti volatili noti per la loro attività antimicrobica e insetticida ad ampio spettro, e la loro struttura, attività biologica e contenuto variano ampiamente tra le specie di Brassicaceae42,59,62,63.
Sebbene sia noto che gli isotiocianati derivati dalla farina di semi di senape possiedano attività insetticida, mancano dati sulla loro attività biologica contro vettori artropodi di importanza medica. Il nostro studio ha esaminato l'attività larvicida di quattro polveri di semi sgrassati contro le larve di zanzara del genere Aedes. L'obiettivo dello studio era valutare il loro potenziale utilizzo come biopesticidi ecocompatibili per il controllo delle zanzare. Sono stati inoltre testati tre componenti chimici principali della farina di semi: l'isotiocianato di allile (AITC), l'isotiocianato di benzile (BITC) e l'isotiocianato di 4-idrossibenzili (4-HBITC), al fine di valutarne l'attività biologica sulle larve di zanzara. Questo è il primo studio a valutare l'efficacia di quattro polveri di semi di cavolo e dei loro principali componenti chimici contro le larve di zanzara.
Le colonie di laboratorio di Aedes aegypti (ceppo Rockefeller) sono state mantenute a 26 °C, 70% di umidità relativa (UR) e fotoperiodo di 10:14 ore (luce:buio). Le femmine accoppiate sono state alloggiate in gabbie di plastica (altezza 11 cm e diametro 9,5 cm) e alimentate tramite un sistema di alimentazione con biberon utilizzando sangue bovino citrato (HemoStat Laboratories Inc., Dixon, CA, USA). L'alimentazione con sangue è stata effettuata come di consueto utilizzando un alimentatore a membrana multivetro (Chemglass, Life Sciences LLC, Vineland, NJ, USA) collegato a un tubo a bagno termostatico a circolazione d'acqua (HAAKE S7, Thermo-Scientific, Waltham, MA, USA) con controllo della temperatura a 37 °C. Una pellicola di Parafilm M è stata stesa sul fondo di ciascuna camera di alimentazione in vetro (area 154 mm²). Ogni alimentatore è stato quindi posizionato sulla griglia superiore che copriva la gabbia contenente la femmina in accoppiamento. Circa 350-400 μl di sangue bovino sono stati aggiunti a un imbuto di vetro per alimentazione utilizzando una pipetta Pasteur (Fisherbrand, Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) e i vermi adulti sono stati lasciati sgocciolare per almeno un'ora. Alle femmine gravide è stata quindi somministrata una soluzione di saccarosio al 10% e sono state lasciate deporre le uova su carta da filtro umida foderata in singole coppette da soufflé ultra-trasparenti (1,25 fl oz, Dart Container Corp., Mason, MI, USA). gabbia con acqua. Mettere la carta da filtro contenente le uova in un sacchetto sigillato (SC Johnsons, Racine, WI) e conservare a 26 °C. Le uova sono state schiuse e circa 200-250 larve sono state allevate in vassoi di plastica contenenti una miscela di mangime per conigli (ZuPreem, Premium Natural Products, Inc., Mission, KS, USA) e polvere di fegato (MP Biomedicals, LLC, Solon, OH, USA). e filetto di pesce (TetraMin, Tetra GMPH, Meer, Germania) in un rapporto di 2:1:1. Nei nostri bioassay sono state utilizzate larve al terzo stadio avanzato.
Il materiale vegetale utilizzato in questo studio è stato ottenuto dalle seguenti fonti commerciali e governative: Brassica juncea (senape bruna - Pacific Gold) e Brassica juncea (senape bianca - Ida Gold) dalla Pacific Northwest Farmers' Cooperative, Stato di Washington, USA; (Crescione da giardino) dalla Kelly Seed and Hardware Co., Peoria, IL, USA e Thlaspi arvense (Thlaspi arvense - Elizabeth) dall'USDA-ARS, Peoria, IL, USA; Nessuno dei semi utilizzati nello studio è stato trattato con pesticidi. Tutto il materiale vegetale è stato lavorato e utilizzato in questo studio in conformità con le normative locali e nazionali e nel rispetto di tutte le normative locali, statali e nazionali pertinenti. Questo studio non ha esaminato varietà di piante transgeniche.
I semi di Brassica juncea (PG), Alfalfa (Ls), senape bianca (IG) e Thlaspi arvense (DFP) sono stati macinati fino a ottenere una polvere fine utilizzando un mulino ultracentrifugo Retsch ZM200 (Retsch, Haan, Germania) dotato di una rete da 0,75 mm e rotore in acciaio inox a 12 denti e 10.000 giri/min (Tabella 1). La polvere di semi macinati è stata trasferita su un ditale di carta e sgrassata con esano in un estrattore Soxhlet per 24 ore. Un sottocampione di senape da campo sgrassata è stato trattato termicamente a 100 °C per 1 ora per denaturare la mirosinasi e prevenire l'idrolisi dei glucosinolati per formare isotiocianati biologicamente attivi. La polvere di semi di equiseto trattata termicamente (DFP-HT) è stata utilizzata come controllo negativo mediante denaturazione della mirosinasi.
Il contenuto di glucosinolati nella farina di semi sgrassata è stato determinato in triplicato utilizzando la cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) secondo un protocollo precedentemente pubblicato⁶⁴. In breve, 3 mL di metanolo sono stati aggiunti a un campione di 250 mg di polvere di semi sgrassata. Ciascun campione è stato sonicato in un bagno d'acqua per 30 minuti e lasciato al buio a 23 °C per 16 ore. Un'aliquota di 1 mL dello strato organico è stata quindi filtrata attraverso un filtro da 0,45 μm in un autocampionatore. Utilizzando un sistema HPLC Shimadzu (due pompe LC 20AD; autocampionatore SIL 20A; degassatore DGU 20As; rivelatore UV-VIS SPD-20A per il monitoraggio a 237 nm; e modulo bus di comunicazione CBM-20A), il contenuto di glucosinolati nella farina di semi è stato determinato in triplicato. Utilizzando il software Shimadzu LC Solution versione 1.25 (Shimadzu Corporation, Columbia, MD, USA). La colonna utilizzata era una colonna a fase inversa C18 Inertsil (250 mm × 4,6 mm; RP C-18, ODS-3, 5u; GL Sciences, Torrance, CA, USA). Le condizioni iniziali della fase mobile erano impostate a 12% metanolo/88% idrossido di tetrabutilammonio 0,01 M in acqua (TBAH; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) con una portata di 1 mL/min. Dopo l'iniezione di 15 μl di campione, le condizioni iniziali sono state mantenute per 20 minuti, quindi il rapporto del solvente è stato regolato al 100% metanolo, con un tempo totale di analisi del campione di 65 minuti. Una curva standard (basata su nM/mAb) è stata generata mediante diluizioni seriali di standard di sinapina, glucosinolati e mirosina preparati di fresco (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) per stimare il contenuto di zolfo della farina di semi sgrassata. glucosinolati. Le concentrazioni di glucosinolati nei campioni sono state testate su un Agilent 1100 HPLC (Agilent, Santa Clara, CA, USA) utilizzando la versione OpenLAB CDS ChemStation (C.01.07 SR2 [255]) dotato della stessa colonna e utilizzando un metodo precedentemente descritto. Le concentrazioni di glucosinolati sono state determinate; essere comparabili tra i sistemi HPLC.
L'isotiocianato di allile (94%, stabile) e l'isotiocianato di benzile (98%) sono stati acquistati da Fisher Scientific (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Il 4-idrossibenzilisotiocianato è stato acquistato da ChemCruz (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA). Quando idrolizzati enzimaticamente dalla mirosinasi, i glucosinolati, i glucosinolati e i glucosinolati formano rispettivamente isotiocianato di allile, isotiocianato di benzile e 4-idrossibenzilisotiocianato.
I bioassay di laboratorio sono stati eseguiti secondo il metodo di Muturi et al. 32 con modifiche. Nello studio sono stati utilizzati cinque mangimi a base di semi a basso contenuto di grassi: DFP, DFP-HT, IG, PG e Ls. Venti larve sono state poste in un becher monouso a tre vie da 400 mL (VWR International, LLC, Radnor, PA, USA) contenente 120 mL di acqua deionizzata (dH2O). Sono state testate sette concentrazioni di farina di semi per la tossicità sulle larve di zanzara: 0,01, 0,02, 0,04, 0,06, 0,08, 0,1 e 0,12 g di farina di semi/120 ml di dH2O per la farina di semi DFP, DFP-HT, IG e PG. I bioassay preliminari indicano che la farina di semi Ls sgrassata è più tossica delle altre quattro farine di semi testate. Pertanto, abbiamo regolato le sette concentrazioni di trattamento della farina di semi di Ls alle seguenti concentrazioni: 0,015, 0,025, 0,035, 0,045, 0,055, 0,065 e 0,075 g/120 mL di H2O distillata.
È stato incluso un gruppo di controllo non trattato (dH20, senza aggiunta di farina di semi) per valutare la normale mortalità degli insetti nelle condizioni di prova. I bioassay tossicologici per ciascuna farina di semi includevano tre becher a tre pendenze replicati (20 larve di terzo stadio avanzato per becher), per un totale di 108 provette. I contenitori trattati sono stati conservati a temperatura ambiente (20-21 °C) e la mortalità larvale è stata registrata durante 24 e 72 ore di esposizione continua alle concentrazioni di trattamento. Se il corpo e gli arti della zanzara non si muovono quando vengono perforati o toccati con una spatola sottile di acciaio inossidabile, le larve di zanzara sono considerate morte. Le larve morte di solito rimangono immobili in posizione dorsale o ventrale sul fondo del contenitore o sulla superficie dell'acqua. L'esperimento è stato ripetuto tre volte in giorni diversi utilizzando gruppi di larve diversi, per un totale di 180 larve esposte a ciascuna concentrazione di trattamento.
La tossicità di AITC, BITC e 4-HBITC sulle larve di zanzara è stata valutata utilizzando la stessa procedura di bioassay ma con trattamenti diversi. Preparare soluzioni stock a 100.000 ppm per ciascuna sostanza chimica aggiungendo 100 µL della sostanza chimica a 900 µL di etanolo assoluto in una provetta da centrifuga da 2 mL e agitando per 30 secondi per miscelare accuratamente. Le concentrazioni di trattamento sono state determinate sulla base dei nostri bioassay preliminari, che hanno rilevato che il BITC è molto più tossico di AITC e 4-HBITC. Per determinare la tossicità, sono state utilizzate 5 concentrazioni di BITC (1, 3, 6, 9 e 12 ppm), 7 concentrazioni di AITC (5, 10, 15, 20, 25, 30 e 35 ppm) e 6 concentrazioni di 4-HBITC (15, 15, 20, 25, 30 e 35 ppm). 30, 45, 60, 75 e 90 ppm). Il trattamento di controllo è stato iniettato con 108 μL di etanolo assoluto, equivalente al volume massimo del trattamento chimico. I bioassay sono stati ripetuti come sopra, esponendo un totale di 180 larve per concentrazione di trattamento. La mortalità larvale è stata registrata per ciascuna concentrazione di AITC, BITC e 4-HBITC dopo 24 ore di esposizione continua.
È stata eseguita un'analisi Probit di 65 dati di mortalità dose-dipendente utilizzando il software Polo (Polo Plus, LeOra Software, versione 1.0) per calcolare la concentrazione letale al 50% (LC50), la concentrazione letale al 90% (LC90), la pendenza, il coefficiente di dose letale e la concentrazione letale al 95%. I dati di mortalità si basano su dati replicati combinati di 180 larve esposte a ciascuna concentrazione di trattamento. Le analisi probabilistiche sono state eseguite separatamente per ciascuna farina di semi e ciascun componente chimico. Sulla base dell'intervallo di confidenza al 95% del rapporto di dose letale, la tossicità della farina di semi e dei costituenti chimici per le larve di zanzara è stata considerata significativamente diversa, quindi un intervallo di confidenza contenente un valore di 1 non era significativamente diverso, P = 0,0566.
I risultati dell'analisi HPLC per la determinazione dei principali glucosinolati nelle farine di semi sgrassati DFP, IG, PG e Ls sono riportati nella Tabella 1. I principali glucosinolati presenti nelle farine di semi analizzate variavano, ad eccezione di DFP e PG, che contenevano entrambi glucosinolati di mirosinasi. Il contenuto di mirosinina in PG era superiore a quello in DFP, rispettivamente 33,3 ± 1,5 e 26,5 ± 0,9 mg/g. La polvere di semi Ls conteneva 36,6 ± 1,2 mg/g di glucoglicone, mentre la polvere di semi IG conteneva 38,0 ± 0,5 mg/g di sinapina.
Le larve delle zanzare Ae. Aedes aegypti sono state uccise quando trattate con farina di semi sgrassata, sebbene l'efficacia del trattamento variasse a seconda della specie vegetale. Solo DFP-NT non è risultato tossico per le larve di zanzara dopo 24 e 72 ore di esposizione (Tabella 2). La tossicità della polvere di semi attiva è aumentata con l'aumentare della concentrazione (Fig. 1A, B). La tossicità della farina di semi per le larve di zanzara è variata significativamente in base all'intervallo di confidenza al 95% del rapporto della dose letale dei valori LC50 nelle valutazioni a 24 e 72 ore (Tabella 3). Dopo 24 ore, l'effetto tossico della farina di semi Ls è risultato maggiore rispetto agli altri trattamenti con farina di semi, con la massima attività e la massima tossicità per le larve (LC50 = 0,04 g/120 ml dH2O). Le larve erano meno sensibili al DFP a 24 ore rispetto ai trattamenti con polvere di semi IG, Ls e PG, con valori di LC50 rispettivamente di 0,115, 0,04 e 0,08 g/120 ml dH2O, che erano statisticamente superiori al valore di LC50 di 0,211 g/120 ml dH2O (Tabella 3). I valori di LC90 di DFP, IG, PG e Ls erano rispettivamente 0,376, 0,275, 0,137 e 0,074 g/120 ml dH2O (Tabella 2). La concentrazione più alta di DPP era di 0,12 g/120 ml dH2O. Dopo 24 ore di valutazione, la mortalità larvale media era solo del 12%, mentre la mortalità media delle larve IG e PG ha raggiunto rispettivamente il 51% e l'82%. Dopo 24 ore di valutazione, la mortalità larvale media per il trattamento con la più alta concentrazione di farina di semi di Ls (0,075 g/120 ml dH2O) è stata del 99% (Fig. 1A).
Le curve di mortalità sono state stimate dalla risposta dose (Probit) delle larve di Ae. Egyptian (larve di terzo stadio) alla concentrazione di farina di semi 24 ore (A) e 72 ore (B) dopo il trattamento. La linea tratteggiata rappresenta la LC50 del trattamento con farina di semi. DFP Thlaspi arvense, DFP-HT Thlaspi arvense inattivata termicamente, IG Sinapsis alba (Ida Gold), PG Brassica juncea (Pacific Gold), Ls Lepidium sativum.
Dopo 72 ore di valutazione, i valori di LC50 delle farine di semi DFP, IG e PG erano rispettivamente 0,111, 0,085 e 0,051 g/120 ml dH2O. Quasi tutte le larve esposte alla farina di semi Ls sono morte dopo 72 ore di esposizione, quindi i dati di mortalità non erano coerenti con l'analisi Probit. Rispetto alle altre farine di semi, le larve erano meno sensibili al trattamento con farina di semi DFP e avevano valori di LC50 statisticamente più elevati (Tabelle 2 e 3). Dopo 72 ore, i valori di LC50 per i trattamenti con farina di semi DFP, IG e PG sono stati stimati rispettivamente a 0,111, 0,085 e 0,05 g/120 ml dH2O. Dopo 72 ore di valutazione, i valori di LC90 delle polveri di semi DFP, IG e PG erano rispettivamente 0,215, 0,254 e 0,138 g/120 ml dH2O. Dopo 72 ore di valutazione, la mortalità larvale media per i trattamenti con farina di semi DFP, IG e PG a una concentrazione massima di 0,12 g/120 ml dH2O era rispettivamente del 58%, 66% e 96% (Fig. 1B). Dopo 72 ore di valutazione, la farina di semi PG è risultata più tossica delle farine di semi IG e DFP.
Gli isotiocianati sintetici, isotiocianato di allile (AITC), isotiocianato di benzile (BITC) e isotiocianato di 4-idrossibenzili (4-HBITC), possono uccidere efficacemente le larve di zanzara. A 24 ore dal trattamento, il BITC è risultato più tossico per le larve con un valore di LC50 di 5,29 ppm rispetto a 19,35 ppm per l'AITC e 55,41 ppm per il 4-HBITC (Tabella 4). Rispetto all'AITC e al BITC, il 4-HBITC presenta una tossicità inferiore e un valore di LC50 più elevato. Esistono differenze significative nella tossicità per le larve di zanzara dei due principali isotiocianati (Ls e PG) presenti nella farina di semi più potente. La tossicità basata sul rapporto della dose letale dei valori LC50 tra AITC, BITC e 4-HBITC ha mostrato una differenza statisticamente significativa tale che l'intervallo di confidenza al 95% del rapporto della dose letale LC50 non includeva il valore 1 (P = 0,05, Tabella 4). Si è stimato che le concentrazioni più elevate sia di BITC che di AITC uccidessero il 100% delle larve testate (Figura 2).
Le curve di mortalità sono state stimate dalla risposta alla dose (Probit) di Ae. 24 ore dopo il trattamento, le larve egiziane (larve di terzo stadio) hanno raggiunto concentrazioni di isotiocianato sintetico. La linea tratteggiata rappresenta la LC50 per il trattamento con isotiocianato. Isotiocianato di benzile BITC, isotiocianato di allile AITC e 4-HBITC.
L'utilizzo di biopesticidi vegetali come agenti di controllo dei vettori di zanzare è stato oggetto di studio per lungo tempo. Molte piante producono sostanze chimiche naturali con attività insetticida37. I loro composti bioattivi rappresentano un'alternativa interessante agli insetticidi sintetici, con un grande potenziale nel controllo dei parassiti, comprese le zanzare.
Le piante di senape vengono coltivate per i loro semi, utilizzati come spezia e come fonte di olio. Quando l'olio di senape viene estratto dai semi o quando la senape viene estratta per essere utilizzata come biocarburante, il sottoprodotto è la farina di semi sgrassata. Questa farina di semi conserva molti dei suoi componenti biochimici naturali e degli enzimi idrolitici. La tossicità di questa farina di semi è attribuita alla produzione di isotiocianati. Gli isotiocianati si formano per idrolisi dei glucosinolati da parte dell'enzima mirosinasi durante l'idratazione della farina di semi e sono noti per avere effetti fungicidi, battericidi, nematocidi e insetticidi, nonché altre proprietà tra cui effetti sensoriali chimici e proprietà chemioterapiche. Diversi studi hanno dimostrato che le piante di senape e la farina di semi agiscono efficacemente come fumiganti contro i parassiti del suolo e degli alimenti immagazzinati. In questo studio, abbiamo valutato la tossicità della farina di quattro semi e dei suoi tre prodotti bioattivi AITC, BITC e 4-HBITC sulle larve di zanzara Aedes aegypti. L'aggiunta diretta della farina di semi all'acqua contenente larve di zanzara dovrebbe attivare processi enzimatici che producono isotiocianati, tossici per le larve stesse. Questa biotrasformazione è stata in parte dimostrata dall'attività larvicida osservata nella farina di semi e dalla perdita di attività insetticida quando la farina di semi di senape nana è stata trattata termicamente prima dell'uso. Il trattamento termico dovrebbe distruggere gli enzimi idrolitici che attivano i glucosinolati, impedendo così la formazione di isotiocianati bioattivi. Questo è il primo studio a confermare le proprietà insetticide della polvere di semi di cavolo contro le zanzare in un ambiente acquatico.
Tra le polveri di semi testate, la polvere di semi di crescione (Ls) è risultata la più tossica, causando un'elevata mortalità di Aedes albopictus. Le larve di Aedes aegypti sono state trattate ininterrottamente per 24 ore. Le restanti tre polveri di semi (PG, IG e DFP) hanno mostrato un'attività più lenta e hanno comunque causato una mortalità significativa dopo 72 ore di trattamento continuo. Solo la farina di semi di Ls conteneva quantità significative di glucosinolati, mentre PG e DFP contenevano mirosinasi e IG conteneva glucosinolato come principale glucosinolato (Tabella 1). La glucotropaeolina viene idrolizzata in BITC e la sinalbina in 4-HBITC61,62. I nostri risultati di bioassay indicano che sia la farina di semi di Ls che il BITC sintetico sono altamente tossici per le larve di zanzara. Il componente principale della farina di semi di PG e DFP è il glucosinolato di mirosinasi, che viene idrolizzato in AITC. L'AITC è efficace nell'uccidere le larve di zanzara con un valore di LC50 di 19,35 ppm. Rispetto all'AITC e al BITC, l'isotiocianato di 4-HBITC è il meno tossico per le larve. Sebbene l'AITC sia meno tossico del BITC, i loro valori di LC50 sono inferiori a quelli di molti oli essenziali testati sulle larve di zanzara32,73,74,75.
La nostra polvere di semi di crucifere per il trattamento delle larve di zanzara contiene un glucosinolato principale, che rappresenta oltre il 98-99% dei glucosinolati totali, come determinato mediante HPLC. Sono state rilevate tracce di altri glucosinolati, ma i loro livelli erano inferiori allo 0,3% dei glucosinolati totali. La polvere di semi di crescione (L. sativum) contiene glucosinolati secondari (sinigrina), ma la loro proporzione è dell'1% dei glucosinolati totali e il loro contenuto è comunque insignificante (circa 0,4 mg/g di polvere di semi). Sebbene PG e DFP contengano lo stesso glucosinolato principale (mirosina), l'attività larvicida delle loro farine di semi differisce significativamente a causa dei loro valori di LC50. La tossicità per l'oidio varia. La comparsa di larve di Aedes aegypti potrebbe essere dovuta a differenze nell'attività o nella stabilità della mirosinasi tra le due farine di semi. L'attività della mirosinasi svolge un ruolo importante nella biodisponibilità dei prodotti di idrolisi come gli isotiocianati nelle piante di Brassicaceae76. Precedenti studi di Pocock et al.77 e Wilkinson et al.78 hanno dimostrato che i cambiamenti nell'attività e nella stabilità della mirosinasi possono essere associati anche a fattori genetici e ambientali.
Il contenuto previsto di isotiocianati bioattivi è stato calcolato in base ai valori di LC50 di ciascuna farina di semi a 24 e 72 ore (Tabella 5) per il confronto con le corrispondenti applicazioni chimiche. Dopo 24 ore, gli isotiocianati nella farina di semi erano più tossici dei composti puri. I valori di LC50 calcolati in base alle parti per milione (ppm) dei trattamenti con isotiocianati nei semi erano inferiori ai valori di LC50 per le applicazioni di BITC, AITC e 4-HBITC. Abbiamo osservato le larve consumare i pellet di farina di semi (Figura 3A). Di conseguenza, le larve potrebbero essere esposte a una concentrazione maggiore di isotiocianati tossici ingerendo i pellet di farina di semi. Ciò è risultato più evidente nei trattamenti con farina di semi IG e PG a 24 ore di esposizione, dove le concentrazioni di LC50 erano inferiori rispettivamente del 75% e del 72% rispetto ai trattamenti con AITC e 4-HBITC puri. I trattamenti con Ls e DFP sono risultati più tossici dell'isotiocianato puro, con valori di LC50 inferiori rispettivamente del 24% e del 41%. Le larve nel trattamento di controllo si sono impupate con successo (Fig. 3B), mentre la maggior parte delle larve nel trattamento con farina di semi non si è impupata e lo sviluppo larvale è risultato significativamente ritardato (Fig. 3B,D). In Spodopteralitura, gli isotiocianati sono associati a ritardo della crescita e ritardo dello sviluppo79.
Larve di zanzare Ae. Aedes aegypti sono state esposte continuamente a polvere di semi di Brassica per 24-72 ore. (A) Larve morte con particelle di farina di semi nell'apparato boccale (cerchiate); (B) Il trattamento di controllo (dH20 senza aggiunta di farina di semi) mostra che le larve crescono normalmente e iniziano a impuparsi dopo 72 ore (C, D) Larve trattate con farina di semi; la farina di semi ha mostrato differenze nello sviluppo e non ha impupato.
Non abbiamo studiato il meccanismo degli effetti tossici degli isotiocianati sulle larve di zanzara. Tuttavia, studi precedenti sulle formiche rosse del fuoco (Solenopsis invicta) hanno dimostrato che l'inibizione della glutatione S-transferasi (GST) e dell'esterasi (EST) è il principale meccanismo di bioattività degli isotiocianati, e l'AITC, anche a basse concentrazioni, può inibire l'attività della GST. Al contrario, l'AITC inibisce l'acetilcolinesterasi negli adulti del punteruolo del mais (Sitophilus zeamais)81. Studi simili devono essere condotti per chiarire il meccanismo di attività degli isotiocianati nelle larve di zanzara.
Utilizziamo il trattamento DFP inattivato termicamente per supportare l'ipotesi che l'idrolisi dei glucosinolati vegetali per formare isotiocianati reattivi funga da meccanismo di controllo delle larve di zanzara da parte della farina di semi di senape. La farina di semi DFP-HT non è risultata tossica alle dosi di applicazione testate. Lafarga et al. 82 hanno riportato che i glucosinolati sono sensibili alla degradazione ad alte temperature. Si prevede inoltre che il trattamento termico denaturi l'enzima mirosinasi nella farina di semi e impedisca l'idrolisi dei glucosinolati per formare isotiocianati reattivi. Ciò è stato confermato anche da Okunade et al. 75, i quali hanno dimostrato che la mirosinasi è termosensibile, mostrando che l'attività della mirosinasi è stata completamente inattivata quando i semi di senape, senape nera e sanguinaria sono stati esposti a temperature superiori a 80 °C. Questi meccanismi possono comportare la perdita di attività insetticida della farina di semi DFP trattata termicamente.
Pertanto, la farina di semi di senape e i suoi tre principali isotiocianati sono tossici per le larve di zanzara. Date queste differenze tra la farina di semi e i trattamenti chimici, l'uso della farina di semi potrebbe rappresentare un metodo efficace per il controllo delle zanzare. È necessario individuare formulazioni idonee e sistemi di rilascio efficaci per migliorare l'efficacia e la stabilità dell'uso delle polveri di semi. I nostri risultati indicano il potenziale utilizzo della farina di semi di senape come alternativa ai pesticidi sintetici. Questa tecnologia potrebbe diventare uno strumento innovativo per il controllo dei vettori di zanzare. Poiché le larve di zanzara prosperano negli ambienti acquatici e i glucosinolati della farina di semi vengono convertiti enzimaticamente in isotiocianati attivi in seguito all'idratazione, l'uso della farina di semi di senape in acque infestate da zanzare offre un significativo potenziale di controllo. Sebbene l'attività larvicida degli isotiocianati vari (BITC > AITC > 4-HBITC), sono necessarie ulteriori ricerche per determinare se la combinazione della farina di semi con più glucosinolati aumenti sinergicamente la tossicità. Questo è il primo studio a dimostrare gli effetti insetticidi della farina di semi di crucifere sgrassata e di tre isotiocianati bioattivi sulle zanzare. I risultati di questo studio aprono nuove prospettive, mostrando che la farina di semi di cavolo sgrassata, un sottoprodotto dell'estrazione dell'olio dai semi, può rappresentare un promettente agente larvicida per il controllo delle zanzare. Queste informazioni possono contribuire alla scoperta di agenti di biocontrollo vegetali e al loro sviluppo come biopesticidi economici, pratici ed ecocompatibili.
I set di dati generati per questo studio e le relative analisi sono disponibili presso l'autore corrispondente su richiesta motivata. Al termine dello studio, tutto il materiale utilizzato (insetti e farina di semi) è stato distrutto.
Data di pubblicazione: 29-lug-2024