Per efficacementecontrollare le zanzaree ridurre l'incidenza delle malattie che trasmettono, sono necessarie alternative strategiche, sostenibili ed ecocompatibili ai pesticidi chimici. Abbiamo valutato le farine di semi di alcune Brassicaceae (famiglia Brassica) come fonte di isotiocianati di origine vegetale, prodotti per idrolisi enzimatica di glucosinolati biologicamente inattivi, da utilizzare nel controllo di Aedes egiziana (L., 1762). Farina di semi cinque volte sgrassata (Brassica juncea (L) Czern., 1859, Lepidium sativum L., 1753, Sinapis alba L., 1753, Thlaspi arvense L., 1753 e Thlaspi arvense – tre tipi principali di inattivazione termica e degradazione enzimatica Prodotti chimici Per determinare la tossicità (LC50) dell'isotiocianato di allile, dell'isotiocianato di benzile e del 4-idrossibenzilisotiocianato per le larve di Aedes aegypti a 24 ore di esposizione = 0,04 g/120 ml dH2O). Valori LC50 per senape, senape bianca ed equiseto. La farina di semi era rispettivamente pari a 0,05, 0,08 e 0,05 rispetto all'isotiocianato di allile (LC50 = 19,35 ppm) e al 4-idrossibenzilisotiocianato (LC50 = 55,41 ppm) che si è rivelato più tossico per le larve 24 ore dopo il trattamento rispetto a 0,1 g/120 ml dH2O rispettivamente. Questi risultati sono coerenti con la produzione di farina di semi di erba medica. La maggiore efficienza degli esteri benzilici corrisponde ai valori di LC50 calcolati. L'uso della farina di semi può fornire un metodo efficace per il controllo delle zanzare. L'efficacia della polvere di semi di crocifere e dei suoi principali componenti chimici contro le larve di zanzara mostra come i composti naturali presenti nella polvere di semi di crocifere possano fungere da promettente larvicida ecologico per il controllo delle zanzare.
Le malattie trasmesse da vettori causate dalle zanzare Aedes rimangono un grave problema di salute pubblica globale. L'incidenza delle malattie trasmesse dalle zanzare si diffonde geograficamente1,2,3 e riemerge, causando epidemie gravi4,5,6,7. La diffusione di malattie tra esseri umani e animali (ad esempio, chikungunya, dengue, febbre della Rift Valley, febbre gialla e virus Zika) è senza precedenti. La sola febbre dengue mette a rischio di infezione circa 3,6 miliardi di persone ai tropici, con una stima di 390 milioni di infezioni che si verificano ogni anno, con conseguenti 6.100-24.300 decessi all'anno8. La ricomparsa e l'epidemia del virus Zika in Sud America hanno attirato l'attenzione mondiale a causa dei danni cerebrali che provoca nei bambini nati da donne infette2. Kremer et al.3 prevedono che l'areale geografico delle zanzare Aedes continuerà ad espandersi e che entro il 2050, metà della popolazione mondiale sarà a rischio di infezione da arbovirus trasmessi dalle zanzare.
Ad eccezione dei vaccini recentemente sviluppati contro la dengue e la febbre gialla, non sono ancora stati sviluppati vaccini contro la maggior parte delle malattie trasmesse dalle zanzare9,10,11. I vaccini sono ancora disponibili in quantità limitate e vengono utilizzati solo in sperimentazioni cliniche. Il controllo delle zanzare vettori mediante insetticidi sintetici è stata una strategia chiave per controllare la diffusione delle malattie trasmesse dalle zanzare12,13. Sebbene i pesticidi sintetici siano efficaci nell'uccidere le zanzare, il loro uso continuato influisce negativamente sugli organismi non bersaglio e inquina l'ambiente14,15,16. Ancora più allarmante è la tendenza alla crescente resistenza delle zanzare agli insetticidi chimici17,18,19. Questi problemi associati ai pesticidi hanno accelerato la ricerca di alternative efficaci ed ecocompatibili per il controllo dei vettori delle malattie.
Diverse piante sono state sviluppate come fonti di fitopestidi per il controllo dei parassiti20,21. Le sostanze vegetali sono generalmente ecocompatibili perché biodegradabili e presentano una tossicità bassa o trascurabile per organismi non bersaglio come mammiferi, pesci e anfibi20,22. È noto che le preparazioni erboristiche producono una varietà di composti bioattivi con diversi meccanismi d'azione per controllare efficacemente le diverse fasi vitali delle zanzare23,24,25,26. Composti di origine vegetale come oli essenziali e altri principi attivi vegetali hanno attirato l'attenzione e hanno aperto la strada a strumenti innovativi per il controllo delle zanzare vettori. Oli essenziali, monoterpeni e sesquiterpeni agiscono come repellenti, deterrenti per l'alimentazione e ovicidi27,28,29,30,31,32,33. Molti oli vegetali causano la morte di larve, pupe e adulti di zanzara34,35,36, colpendo il sistema nervoso, respiratorio, endocrino e altri importanti sistemi degli insetti37.
Studi recenti hanno fornito informazioni sul potenziale utilizzo delle piante di senape e dei loro semi come fonte di composti bioattivi. La farina di semi di senape è stata testata come biofumigante38,39,40,41 e utilizzata come ammendante del terreno per la soppressione delle erbe infestanti42,43,44 e il controllo di patogeni vegetali terricoli45,46,47,48,49,50, per la nutrizione delle piante, per nematodi 41,51, 52, 53, 54 e per parassiti 55, 56, 57, 58, 59, 60. L'attività fungicida di queste polveri di semi è attribuita a composti fitoprotettivi chiamati isotiocianati38,42,60. Nelle piante, questi composti protettivi sono immagazzinati nelle cellule vegetali sotto forma di glucosinolati non bioattivi. Tuttavia, quando le piante vengono danneggiate dall'alimentazione di insetti o da infezioni patogene, i glucosinolati vengono idrolizzati dalla mirosinasi in isotiocianati bioattivi55,61. Gli isotiocianati sono composti volatili noti per la loro attività antimicrobica e insetticida ad ampio spettro, e la loro struttura, attività biologica e contenuto variano ampiamente tra le specie di Brassicaceae42,59,62,63.
Sebbene sia nota l'attività insetticida degli isotiocianati derivati dalla farina di semi di senape, mancano dati sull'attività biologica contro artropodi vettori di importanza medica. Il nostro studio ha esaminato l'attività larvicida di quattro polveri di semi sgrassati contro le zanzare Aedes. Larve di Aedes aegypti. Lo scopo dello studio era di valutarne il potenziale utilizzo come biopesticidi ecocompatibili per il controllo delle zanzare. Sono stati inoltre testati tre principali componenti chimici della farina di semi, l'isotiocianato di allile (AITC), l'isotiocianato di benzile (BITC) e il 4-idrossibenzilisotiocianato (4-HBITC), per testarne l'attività biologica sulle larve di zanzara. Questo è il primo rapporto a valutare l'efficacia di quattro polveri di semi di cavolo e dei loro principali componenti chimici contro le larve di zanzara.
Colonie di laboratorio di Aedes aegypti (ceppo Rockefeller) sono state mantenute a 26 °C, 70% di umidità relativa (UR) e 10:14 ore (fotoperiodo L:D). Le femmine accoppiate sono state alloggiate in gabbie di plastica (altezza 11 cm e diametro 9,5 cm) e alimentate tramite un sistema di alimentazione a biberon con sangue bovino citrato (HemoStat Laboratories Inc., Dixon, CA, USA). L'alimentazione con sangue è stata effettuata come di consueto utilizzando un alimentatore multi-vetro a membrana (Chemglass, Life Sciences LLC, Vineland, NJ, USA) collegato a un bagnomaria a circolazione d'acqua (HAAKE S7, Thermo-Scientific, Waltham, MA, USA) con controllo della temperatura a 37 °C. Stendere una pellicola di Parafilm M sul fondo di ciascuna camera di alimentazione in vetro (area 154 mm²). Ogni alimentatore è stato quindi posizionato sulla griglia superiore che copriva la gabbia contenente la femmina accoppiata. Circa 350-400 μl di sangue bovino sono stati aggiunti a un imbuto di alimentazione in vetro utilizzando una pipetta Pasteur (Fisherbrand, Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) e i vermi adulti sono stati lasciati scolare per almeno un'ora. Alle femmine gravide è stata quindi somministrata una soluzione di saccarosio al 10% e sono state lasciate deporre le uova su carta da filtro umida, rivestite in coppette da soufflé ultra-trasparenti individuali (37 ml, Dart Container Corp., Mason, MI, USA). La gabbia è stata riempita con acqua. Inserire la carta da filtro contenente le uova in un sacchetto sigillato (SC Johnsons, Racine, WI) e conservare a 26 °C. Le uova sono state schiuse e circa 200-250 larve sono state allevate in vassoi di plastica contenenti una miscela di cibo per conigli (ZuPreem, Premium Natural Products, Inc., Mission, KS, USA) e polvere di fegato (MP Biomedicals, LLC, Solon, OH, USA). e filetto di pesce (TetraMin, Tetra GMPH, Meer, Germania) in un rapporto di 2:1:1. Nei nostri biotest sono state utilizzate larve di terzo stadio avanzato.
Il materiale di semi vegetali utilizzato in questo studio è stato ottenuto dalle seguenti fonti commerciali e governative: Brassica juncea (senape bruna - Pacific Gold) e Brassica juncea (senape bianca - Ida Gold) dalla Pacific Northwest Farmers' Cooperative, Stato di Washington, USA; (crescione) da Kelly Seed and Hardware Co., Peoria, IL, USA e Thlaspi arvense (crescione dei campi - Elisabeth) da USDA-ARS, Peoria, IL, USA; Nessuno dei semi utilizzati nello studio è stato trattato con pesticidi. Tutto il materiale di semi è stato lavorato e utilizzato in questo studio in conformità con le normative locali e nazionali e in conformità con tutte le normative locali, statali e nazionali pertinenti. Questo studio non ha esaminato varietà vegetali transgeniche.
I semi di Brassica juncea (PG), Alfalfa (Ls), Senape bianca (IG), Thlaspi arvense (DFP) sono stati macinati fino a ottenere una polvere fine utilizzando un mulino ultracentrifugo Retsch ZM200 (Retsch, Haan, Germania) dotato di una maglia da 0,75 mm e un rotore in acciaio inossidabile, 12 denti, 10.000 giri/min (Tabella 1). La polvere di semi macinata è stata trasferita in un ditale di carta e sgrassata con esano in un apparecchio Soxhlet per 24 ore. Un sottocampione di senape campestre sgrassata è stato trattato termicamente a 100 °C per 1 ora per denaturare la mirosinasi e prevenire l'idrolisi dei glucosinolati a formare isotiocianati biologicamente attivi. La polvere di semi di equiseto trattata termicamente (DFP-HT) è stata utilizzata come controllo negativo denaturando la mirosinasi.
Il contenuto di glucosinolati nella farina di semi sgrassata è stato determinato in triplicato utilizzando la cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) secondo un protocollo precedentemente pubblicato 64 . In breve, 3 mL di metanolo sono stati aggiunti a un campione di 250 mg di polvere di semi sgrassata. Ogni campione è stato sonicato in un bagno d'acqua per 30 minuti e lasciato al buio a 23 °C per 16 ore. Un'aliquota di 1 mL dello strato organico è stata quindi filtrata attraverso un filtro da 0,45 μm in un autocampionatore. Utilizzando un sistema HPLC Shimadzu (due pompe LC 20AD; autocampionatore SIL 20A; degasatore DGU 20As; rivelatore UV-VIS SPD-20A per il monitoraggio a 237 nm; e modulo bus di comunicazione CBM-20A), il contenuto di glucosinolati nella farina di semi è stato determinato in triplicato . Utilizzando il software Shimadzu LC Solution versione 1.25 (Shimadzu Corporation, Columbia, MD, USA). La colonna utilizzata era una colonna a fase inversa C18 Inertsil (250 mm × 4,6 mm; RP C-18, ODS-3, 5u; GL Sciences, Torrance, CA, USA). Le condizioni iniziali della fase mobile sono state impostate al 12% di metanolo/88% di idrossido di tetrabutilammonio 0,01 M in acqua (TBAH; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) con una portata di 1 mL/min. Dopo l'iniezione di 15 μl di campione, le condizioni iniziali sono state mantenute per 20 minuti, quindi il rapporto solvente è stato regolato al 100% di metanolo, con un tempo totale di analisi del campione di 65 minuti. Una curva standard (basata su nM/mAb) è stata generata mediante diluizioni seriali di standard di sinapina, glucosinolato e mirosina preparati al momento (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) per stimare il contenuto di zolfo della farina di semi sgrassata. glucosinolati. Le concentrazioni di glucosinolati nei campioni sono state testate su un HPLC Agilent 1100 (Agilent, Santa Clara, CA, USA) utilizzando la versione OpenLAB CDS ChemStation (C.01.07 SR2 [255]) dotata della stessa colonna e utilizzando un metodo precedentemente descritto. Le concentrazioni di glucosinolati sono state determinate; essere comparabili tra i sistemi HPLC.
L'isotiocianato di allile (94%, stabile) e l'isotiocianato di benzile (98%) sono stati acquistati da Fisher Scientific (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Il 4-idrossibenzilisotiocianato è stato acquistato da ChemCruz (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA). Quando idrolizzati enzimaticamente dalla mirosinasi, glucosinolati, glucosinolati e glucosinolati formano rispettivamente isotiocianato di allile, isotiocianato di benzile e 4-idrossibenzilisotiocianato.
I biotest di laboratorio sono stati eseguiti secondo il metodo di Muturi et al. 32 con modifiche. Nello studio sono stati utilizzati cinque mangimi a basso contenuto di grassi: DFP, DFP-HT, IG, PG e Ls. Venti larve sono state poste in un becher monouso a tre vie da 400 mL (VWR International, LLC, Radnor, PA, USA) contenente 120 mL di acqua deionizzata (dH₂O). Sono state testate sette concentrazioni di farina di semi per la tossicità delle larve di zanzara: 0,01, 0,02, 0,04, 0,06, 0,08, 0,1 e 0,12 g di farina di semi/120 mL dH₂O per farina di semi DFP, DFP-HT, IG e PG. I biotest preliminari indicano che la farina di semi sgrassata di Ls è più tossica di altre quattro farine di semi testate. Pertanto, abbiamo adattato le sette concentrazioni di trattamento della farina di semi di Ls alle seguenti concentrazioni: 0,015, 0,025, 0,035, 0,045, 0,055, 0,065 e 0,075 g/120 mL dH2O.
Un gruppo di controllo non trattato (dH2O, senza supplemento di farina di semi) è stato incluso per valutare la normale mortalità degli insetti in condizioni di saggio. I biotest tossicologici per ciascuna farina di semi includevano tre becher replicati a tre inclinazioni (20 larve di terzo stadio tardivo per becher), per un totale di 108 fiale. I contenitori trattati sono stati conservati a temperatura ambiente (20-21 °C) e la mortalità larvale è stata registrata durante 24 e 72 ore di esposizione continua alle concentrazioni di trattamento. Se il corpo e le appendici della zanzara non si muovono quando vengono forate o toccate con una sottile spatola in acciaio inossidabile, le larve di zanzara sono considerate morte. Le larve morte solitamente rimangono immobili in posizione dorsale o ventrale sul fondo del contenitore o sulla superficie dell'acqua. L'esperimento è stato ripetuto tre volte in giorni diversi utilizzando diversi gruppi di larve, per un totale di 180 larve esposte a ciascuna concentrazione di trattamento.
La tossicità di AITC, BITC e 4-HBITC sulle larve di zanzara è stata valutata utilizzando la stessa procedura di biotest, ma con trattamenti diversi. Preparare soluzioni madre da 100.000 ppm per ciascuna sostanza chimica aggiungendo 100 µL della sostanza chimica a 900 µL di etanolo assoluto in una provetta da centrifuga da 2 mL e agitando per 30 secondi per miscelare accuratamente. Le concentrazioni del trattamento sono state determinate sulla base dei nostri biotest preliminari, che hanno rilevato che BITC è molto più tossico di AITC e 4-HBITC. Per determinare la tossicità, sono state analizzate 5 concentrazioni di BITC (1, 3, 6, 9 e 12 ppm), 7 concentrazioni di AITC (5, 10, 15, 20, 25, 30 e 35 ppm) e 6 concentrazioni di 4-HBITC (15, 15, 20, 25, 30 e 35 ppm). 30, 45, 60, 75 e 90 ppm). Il trattamento di controllo è stato iniettato con 108 μL di etanolo assoluto, equivalente al volume massimo del trattamento chimico. I biotest sono stati ripetuti come sopra, esponendo un totale di 180 larve per concentrazione di trattamento. La mortalità larvale è stata registrata per ciascuna concentrazione di AITC, BITC e 4-HBITC dopo 24 ore di esposizione continua.
L'analisi probit di 65 dati di mortalità dose-correlata è stata eseguita utilizzando il software Polo (Polo Plus, LeOra Software, versione 1.0) per calcolare la concentrazione letale al 50% (LC50), la concentrazione letale al 90% (LC90), la pendenza, il coefficiente di dose letale e la concentrazione letale al 95%. I dati sono basati sugli intervalli di confidenza per i rapporti di dose letale per le curve di concentrazione trasformata in logaritmo e dose-mortalità. I dati di mortalità si basano su dati replicati combinati di 180 larve esposte a ciascuna concentrazione di trattamento. Le analisi probabilistiche sono state eseguite separatamente per ciascuna farina di semi e ciascun componente chimico. Sulla base dell'intervallo di confidenza al 95% del rapporto di dose letale, la tossicità della farina di semi e dei costituenti chimici per le larve di zanzara è stata considerata significativamente diversa, quindi un intervallo di confidenza contenente un valore pari a 1 non era significativamente diverso, P = 0,0566.
I risultati HPLC per la determinazione dei principali glucosinolati nelle farine di semi sgrassate DFP, IG, PG e Ls sono elencati nella Tabella 1. I principali glucosinolati nelle farine di semi testate variavano, ad eccezione di DFP e PG, che contenevano entrambe glucosinolati mirosinasi. Il contenuto di mirosinina nella PG era superiore a quello della DFP, rispettivamente 33,3 ± 1,5 e 26,5 ± 0,9 mg/g. La polvere di semi Ls conteneva 36,6 ± 1,2 mg/g di glucoglicone, mentre la polvere di semi IG conteneva 38,0 ± 0,5 mg/g di sinapina.
Le larve di zanzare Ae. Aedes aegypti sono state uccise quando trattate con farina di semi sgrassata, sebbene l'efficacia del trattamento variasse a seconda della specie vegetale. Solo DFP-NT non si è rivelato tossico per le larve di zanzara dopo 24 e 72 ore di esposizione (Tabella 2). La tossicità della polvere di semi attiva è aumentata con l'aumentare della concentrazione (Fig. 1A, B). La tossicità della farina di semi per le larve di zanzara variava significativamente in base all'intervallo di confidenza al 95% del rapporto di dose letale dei valori di LC50 nelle valutazioni a 24 e 72 ore (Tabella 3). Dopo 24 ore, l'effetto tossico della farina di semi Ls era maggiore rispetto ad altri trattamenti con farina di semi, con la massima attività e la massima tossicità per le larve (LC50 = 0,04 g/120 ml dH2O). Le larve erano meno sensibili al DFP a 24 ore rispetto ai trattamenti con polvere di semi di IG, Ls e PG, con valori di LC50 rispettivamente di 0,115, 0,04 e 0,08 g/120 ml dH2O, statisticamente superiori al valore di LC50 di 0,211 g/120 ml dH2O (Tabella 3). I valori di LC90 di DFP, IG, PG e Ls erano rispettivamente di 0,376, 0,275, 0,137 e 0,074 g/120 ml dH2O (Tabella 2). La concentrazione più elevata di DPP era di 0,12 g/120 ml dH2O. Dopo 24 ore di valutazione, la mortalità larvale media era solo del 12%, mentre la mortalità media delle larve IG e PG raggiungeva rispettivamente il 51% e l'82%. Dopo 24 ore di valutazione, la mortalità larvale media per il trattamento con la più alta concentrazione di farina di semi di Ls (0,075 g/120 ml dH2O) era del 99% (Fig. 1A).
Le curve di mortalità sono state stimate dalla risposta alla dose (Probit) di larve di Ae. Egyptian (larve di 3° stadio) alla concentrazione di farina di semi 24 ore (A) e 72 ore (B) dopo il trattamento. La linea tratteggiata rappresenta la LC50 del trattamento con farina di semi. DFP Thlaspi arvense, DFP-HT Thlaspi arvense inattivato al calore, IG Sinapsis alba (Ida Gold), PG Brassica juncea (Pacific Gold), Ls Lepidium sativum.
Dopo 72 ore di valutazione, i valori di LC50 di farina di semi DFP, IG e PG erano rispettivamente di 0,111, 0,085 e 0,051 g/120 ml dH2O. Quasi tutte le larve esposte a farina di semi Ls sono morte dopo 72 ore di esposizione, pertanto i dati sulla mortalità non erano coerenti con l'analisi Probit. Rispetto ad altre farine di semi, le larve erano meno sensibili al trattamento con farina di semi DFP e presentavano valori di LC50 statisticamente più elevati (Tabelle 2 e 3). Dopo 72 ore, i valori di LC50 per i trattamenti con farina di semi DFP, IG e PG sono stati stimati rispettivamente di 0,111, 0,085 e 0,05 g/120 ml dH2O. Dopo 72 ore di valutazione, i valori di LC90 delle polveri di semi di DFP, IG e PG erano rispettivamente di 0,215, 0,254 e 0,138 g/120 ml dH2O. Dopo 72 ore di valutazione, la mortalità larvale media per i trattamenti con farina di semi di DFP, IG e PG a una concentrazione massima di 0,12 g/120 ml dH2O era rispettivamente del 58%, 66% e 96% (Fig. 1B). Dopo 72 ore di valutazione, la farina di semi di PG è risultata più tossica di quella di IG e DFP.
Gli isotiocianati sintetici, l'isotiocianato di allile (AITC), l'isotiocianato di benzile (BITC) e il 4-idrossibenzilisotiocianato (4-HBITC) possono uccidere efficacemente le larve di zanzara. A 24 ore dal trattamento, il BITC è risultato più tossico per le larve, con un valore di LC50 di 5,29 ppm rispetto ai 19,35 ppm dell'AITC e ai 55,41 ppm del 4-HBITC (Tabella 4). Rispetto ad AITC e BITC, il 4-HBITC presenta una tossicità inferiore e un valore di LC50 più elevato. Esistono differenze significative nella tossicità larvale delle zanzare tra i due principali isotiocianati (Ls e PG) nella farina di semi più potente. La tossicità basata sul rapporto di dose letale dei valori di LC50 tra AITC, BITC e 4-HBITC ha mostrato una differenza statistica tale che l'intervallo di confidenza al 95% del rapporto di dose letale della LC50 non includeva un valore pari a 1 (P = 0,05, Tabella 4). Si stima che le concentrazioni più elevate di BITC e AITC abbiano ucciso il 100% delle larve testate (Figura 2).
Le curve di mortalità sono state stimate dalla dose-risposta (Probit) di Ae. 24 ore dopo il trattamento, le larve egiziane (larve di 3° stadio) hanno raggiunto concentrazioni di isotiocianato sintetico. La linea tratteggiata rappresenta la LC50 per il trattamento con isotiocianato di benzile BITC, isotiocianato di allile AITC e 4-HBITC.
L'uso di biopesticidi vegetali come agenti per il controllo dei vettori delle zanzare è stato a lungo studiato. Molte piante producono sostanze chimiche naturali ad attività insetticida37. I loro composti bioattivi offrono un'alternativa interessante agli insetticidi sintetici, con un grande potenziale nel controllo dei parassiti, comprese le zanzare.
Le piante di senape vengono coltivate per i loro semi, utilizzati come spezia e come fonte di olio. Quando l'olio di senape viene estratto dai semi o quando la senape viene estratta per essere utilizzata come biocarburante,69 il sottoprodotto è la farina di semi sgrassata. Questa farina di semi conserva molti dei suoi componenti biochimici naturali ed enzimi idrolitici. La tossicità di questa farina di semi è attribuita alla produzione di isotiocianati55,60,61. Gli isotiocianati si formano dall'idrolisi dei glucosinolati da parte dell'enzima mirosinasi durante l'idratazione della farina di semi38,55,70 e sono noti per i loro effetti fungicidi, battericidi, nematocidi e insetticidi, oltre ad altre proprietà, tra cui effetti sensoriali chimici e proprietà chemioterapiche61,62,70. Diversi studi hanno dimostrato che le piante di senape e la farina di semi agiscono efficacemente come fumiganti contro i parassiti del suolo e degli alimenti conservati57,59,71,72. In questo studio, abbiamo valutato la tossicità della farina di quattro semi e dei suoi tre prodotti bioattivi AITC, BITC e 4-HBITC sulle larve di zanzara Aedes. Aedes aegypti. Si prevede che l'aggiunta di farina di semi direttamente all'acqua contenente larve di zanzara attivi processi enzimatici che producono isotiocianati tossici per le larve di zanzara. Questa biotrasformazione è stata dimostrata in parte dall'attività larvicida osservata della farina di semi e dalla perdita di attività insetticida quando la farina di semi di senape nana è stata trattata termicamente prima dell'uso. Si prevede che il trattamento termico distrugga gli enzimi idrolitici che attivano i glucosinolati, prevenendo così la formazione di isotiocianati bioattivi. Questo è il primo studio a confermare le proprietà insetticide della polvere di semi di cavolo contro le zanzare in ambiente acquatico.
Tra le polveri di semi testate, la polvere di semi di crescione (Ls) è risultata la più tossica, causando un'elevata mortalità di Aedes albopictus. Le larve di Aedes aegypti sono state trattate ininterrottamente per 24 ore. Le restanti tre polveri di semi (PG, IG e DFP) hanno mostrato un'attività più lenta e hanno comunque causato una mortalità significativa dopo 72 ore di trattamento continuo. Solo la farina di semi Ls conteneva quantità significative di glucosinolati, mentre PG e DFP contenevano mirosinasi e IG conteneva glucosinolato come principale glucosinolato (Tabella 1). La glucotropaeolina viene idrolizzata a BITC e la sinalbina viene idrolizzata a 4-HBITC61,62. I risultati del nostro biotest indicano che sia la farina di semi Ls che il BITC sintetico sono altamente tossici per le larve di zanzara. Il componente principale della farina di semi PG e DFP è il glucosinolato di mirosinasi, che viene idrolizzato ad AITC. L'AITC è efficace nell'uccidere le larve di zanzara con un valore di LC50 di 19,35 ppm. Rispetto ad AITC e BITC, l'isotiocianato di 4-HBITC è il meno tossico per le larve. Sebbene l'AITC sia meno tossico del BITC, i loro valori di LC50 sono inferiori a quelli di molti oli essenziali testati sulle larve di zanzara32,73,74,75.
La nostra polvere di semi di crocifere per l'uso contro le larve di zanzara contiene un glucosinolato principale, che rappresenta oltre il 98-99% dei glucosinolati totali, come determinato tramite HPLC. Sono state rilevate tracce di altri glucosinolati, ma i loro livelli erano inferiori allo 0,3% dei glucosinolati totali. La polvere di semi di crescione (L. sativum) contiene glucosinolati secondari (sinigrina), ma la loro proporzione è pari all'1% dei glucosinolati totali e il loro contenuto è comunque insignificante (circa 0,4 mg/g di polvere di semi). Sebbene PG e DFP contengano lo stesso glucosinolato principale (mirosina), l'attività larvicida delle loro farine di semi differisce significativamente a causa dei loro valori di LC50. La tossicità per l'oidio varia. La comparsa di larve di Aedes aegypti potrebbe essere dovuta a differenze nell'attività della mirosinasi o nella stabilità tra i due mangimi. L'attività della mirosinasi svolge un ruolo importante nella biodisponibilità di prodotti di idrolisi come gli isotiocianati nelle piante di Brassicaceae76. Precedenti studi di Pocock et al.77 e Wilkinson et al.78 hanno dimostrato che le variazioni dell'attività e della stabilità della mirosinasi possono essere associate anche a fattori genetici e ambientali.
Il contenuto previsto di isotiocianati bioattivi è stato calcolato sulla base dei valori di LC50 di ciascuna farina di semi a 24 e 72 ore (Tabella 5) per il confronto con le corrispondenti applicazioni chimiche. Dopo 24 ore, gli isotiocianati nella farina di semi erano più tossici dei composti puri. I valori di LC50 calcolati in parti per milione (ppm) dei trattamenti con isotiocianati erano inferiori ai valori di LC50 per applicazioni BITC, AITC e 4-HBITC. Abbiamo osservato che le larve consumavano pellet di farina di semi (Figura 3A). Di conseguenza, le larve possono ricevere un'esposizione più concentrata agli isotiocianati tossici ingerendo pellet di farina di semi. Ciò è stato più evidente nei trattamenti con farina di semi IG e PG a 24 ore di esposizione, dove le concentrazioni di LC50 erano inferiori rispettivamente del 75% e del 72% rispetto ai trattamenti con AITC e 4-HBITC puri. I trattamenti con Ls e DFP sono risultati più tossici dell'isotiocianato puro, con valori di LC50 inferiori rispettivamente del 24% e del 41%. Le larve nel trattamento di controllo si sono impupate con successo (Fig. 3B), mentre la maggior parte delle larve nel trattamento con farina di semi non si è impupata e lo sviluppo larvale è stato significativamente ritardato (Fig. 3B,D). In Spodopteralitura, gli isotiocianati sono associati a ritardo della crescita e dello sviluppo79.
Le larve di zanzare Ae. Aedes aegypti sono state esposte ininterrottamente alla polvere di semi di Brassica per 24-72 ore. (A) Larve morte con particelle di farina di semi nell'apparato boccale (cerchiate); (B) Il trattamento di controllo (dH2O senza aggiunta di farina di semi) mostra che le larve crescono normalmente e iniziano a impuparsi dopo 72 ore. (C, D) Larve trattate con farina di semi; la farina di semi ha mostrato differenze nello sviluppo e non si è impupata.
Non abbiamo studiato il meccanismo degli effetti tossici degli isotiocianati sulle larve di zanzara. Tuttavia, studi precedenti sulle formiche rosse (Solenopsis invicta) hanno dimostrato che l'inibizione della glutatione S-transferasi (GST) e dell'esterasi (EST) è il principale meccanismo di bioattività degli isotiocianati, e l'AITC, anche a bassa attività, può anch'esso inibire l'attività della GST. formiche rosse importate a basse concentrazioni. La dose è di 0,5 µg/ml80. Al contrario, l'AITC inibisce l'acetilcolinesterasi nei punteruoli adulti del mais (Sitophilus zeamais)81. Studi simili devono essere condotti per chiarire il meccanismo di attività degli isotiocianati nelle larve di zanzara.
Utilizziamo il trattamento con DFP inattivato termicamente per supportare l'ipotesi che l'idrolisi dei glucosinolati vegetali a formare isotiocianati reattivi sia un meccanismo per il controllo delle larve di zanzara mediante farina di semi di senape. La farina di semi DFP-HT non si è dimostrata tossica alle dosi di applicazione testate. Lafarga et al. 82 hanno riportato che i glucosinolati sono sensibili alla degradazione ad alte temperature. Si prevede inoltre che il trattamento termico denatura l'enzima mirosinasi nella farina di semi e previene l'idrolisi dei glucosinolati a formare isotiocianati reattivi. Ciò è stato confermato anche da Okunade et al. 75, che hanno dimostrato che la mirosinasi è sensibile alla temperatura, dimostrando che l'attività della mirosinasi era completamente inattivata quando i semi di senape, senape nera e sanguinaria venivano esposti a temperature superiori a 80 °C. Questi meccanismi possono comportare la perdita dell'attività insetticida della farina di semi DFP trattata termicamente.
Pertanto, la farina di semi di senape e i suoi tre principali isotiocianati sono tossici per le larve di zanzara. Date queste differenze tra la farina di semi e i trattamenti chimici, l'uso della farina di semi può essere un metodo efficace per il controllo delle zanzare. È necessario identificare formulazioni idonee e sistemi di somministrazione efficaci per migliorare l'efficacia e la stabilità dell'uso delle polveri di semi. I nostri risultati indicano il potenziale utilizzo della farina di semi di senape come alternativa ai pesticidi sintetici. Questa tecnologia potrebbe diventare uno strumento innovativo per il controllo delle zanzare vettori. Poiché le larve di zanzara prosperano in ambienti acquatici e i glucosinolati della farina di semi vengono convertiti enzimaticamente in isotiocianati attivi durante l'idratazione, l'uso della farina di semi di senape in acque infestate da zanzare offre un potenziale di controllo significativo. Sebbene l'attività larvicida degli isotiocianati vari (BITC > AITC > 4-HBITC), sono necessarie ulteriori ricerche per determinare se la combinazione sinergica di farina di semi con più glucosinolati aumenti la tossicità. Questo è il primo studio a dimostrare gli effetti insetticidi della farina di semi di crocifere sgrassata e di tre isotiocianati bioattivi sulle zanzare. I risultati di questo studio aprono nuove strade, dimostrando che la farina di semi di cavolo sgrassata, un sottoprodotto dell'estrazione dell'olio dai semi, può fungere da promettente agente larvicida per il controllo delle zanzare. Queste informazioni possono contribuire alla scoperta di agenti di biocontrollo delle piante e al loro sviluppo come biopesticidi economici, pratici ed ecocompatibili.
I set di dati generati per questo studio e le analisi risultanti sono disponibili presso l'autore corrispondente su richiesta ragionevole. Al termine dello studio, tutti i materiali utilizzati (insetti e farina di semi) sono stati distrutti.
Data di pubblicazione: 29 luglio 2024