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Le combinazioni di composti insetticidi di origine vegetale possono mostrare interazioni sinergiche o antagonistiche contro i parassiti. Data la rapida diffusione di malattie trasmesse dalle zanzare Aedes e la crescente resistenza delle popolazioni di zanzare Aedes agli insetticidi tradizionali, sono state formulate e testate ventotto combinazioni di composti terpenici a base di oli essenziali vegetali contro gli stadi larvali e adulti di Aedes aegypti. Cinque oli essenziali vegetali (OE) sono stati inizialmente valutati per la loro efficacia larvicida e contro gli adulti, e in ciascun OE sono stati identificati due composti principali sulla base dei risultati GC-MS. I principali composti identificati sono stati acquistati, ovvero disolfuro di diallile, trisolfuro di diallile, carvone, limonene, eugenolo, metil eugenolo, eucaliptolo, eudesmolo e alfa-pinene di zanzara. Sono state quindi preparate combinazioni binarie di questi composti utilizzando dosi subletali e sono stati testati e determinati i loro effetti sinergici e antagonistici. Le migliori composizioni larvicide si ottengono miscelando limonene con disolfuro di diallile, mentre le migliori composizioni adulticide si ottengono miscelando carvone con limonene. Il larvicida sintetico Temphos, di uso commerciale, e il farmaco per adulti Malathion sono stati testati separatamente e in combinazioni binarie con terpenoidi. I risultati hanno mostrato che la combinazione di temefos e disolfuro di diallile e di malathion ed eudesmolo è risultata la più efficace. Queste potenti combinazioni presentano un potenziale utilizzo contro Aedes aegypti.
Gli oli essenziali vegetali (OE) sono metaboliti secondari contenenti diversi composti bioattivi e stanno acquisendo sempre maggiore importanza come alternativa ai pesticidi sintetici. Non solo sono ecocompatibili e facili da usare, ma sono anche una miscela di diversi composti bioattivi, il che riduce anche la probabilità di sviluppo di resistenza ai farmaci1. Utilizzando la tecnologia GC-MS, i ricercatori hanno esaminato i costituenti di vari oli essenziali vegetali e identificato più di 3.000 composti da 17.500 piante aromatiche2, la maggior parte dei quali è stata testata per le proprietà insetticide e risulta avere effetti insetticidi3,4. Alcuni studi evidenziano che la tossicità del componente principale del composto è uguale o superiore a quella del suo ossido di etilene grezzo. Tuttavia, l'uso di singoli composti può ancora una volta lasciare spazio allo sviluppo di resistenza, come nel caso degli insetticidi chimici5,6. Pertanto, l'attenzione attuale è rivolta alla preparazione di miscele di composti a base di ossido di etilene per migliorare l'efficacia insetticida e ridurre la probabilità di resistenza nelle popolazioni di parassiti bersaglio. I singoli composti attivi presenti negli oli essenziali possono esibire effetti sinergici o antagonistici in combinazione, riflettendo l'attività complessiva dell'olio essenziale, un fatto ben evidenziato in studi condotti da precedenti ricercatori7,8. Il programma di controllo dei vettori include anche gli oli essenziali e i loro componenti. L'attività mosquitocida degli oli essenziali è stata ampiamente studiata sulle zanzare Culex e Anopheles. Diversi studi hanno tentato di sviluppare pesticidi efficaci combinando varie piante con pesticidi sintetici di uso commerciale per aumentare la tossicità complessiva e minimizzare gli effetti collaterali9. Tuttavia, gli studi su tali composti contro Aedes aegypti rimangono rari. I progressi della scienza medica e lo sviluppo di farmaci e vaccini hanno contribuito a combattere alcune malattie trasmesse da vettori. Ma la presenza di diversi sierotipi del virus, trasmesso dalla zanzara Aedes aegypti, ha portato al fallimento dei programmi di vaccinazione. Pertanto, quando si verificano tali malattie, i programmi di controllo dei vettori sono l'unica opzione per prevenirne la diffusione. Nell'attuale contesto, il controllo di Aedes aegypti è di fondamentale importanza, in quanto vettore chiave di diversi virus e dei loro sierotipi responsabili di dengue, Zika, dengue emorragica, febbre gialla, ecc. È particolarmente rilevante il fatto che il numero di casi di quasi tutte le malattie trasmesse da vettori come Aedes sia in aumento ogni anno in Egitto e a livello globale. Pertanto, in questo contesto, è urgente sviluppare misure di controllo efficaci ed ecocompatibili per le popolazioni di Aedes aegypti. Tra i potenziali candidati a tale scopo figurano gli oli essenziali (OE), i loro componenti e le loro combinazioni. Questo studio si propone quindi di identificare combinazioni sinergiche efficaci di composti chiave di oli essenziali vegetali provenienti da cinque piante con proprietà insetticide (menta, basilico sacro, eucalipto maculato, Allium sulfur e melaleuca) contro Aedes aegypti.
Tutti gli oli essenziali selezionati hanno dimostrato una potenziale attività larvicida contro Aedes aegypti con valori di LC50 a 24 ore compresi tra 0,42 e 163,65 ppm. L'attività larvicida più elevata è stata registrata per l'olio essenziale di menta piperita (Mp) con un valore di LC50 di 0,42 ppm a 24 ore, seguito dall'olio essenziale di aglio (As) con un valore di LC50 di 16,19 ppm a 24 ore (Tabella 1).
Ad eccezione dell'olio essenziale di Ocimum Sainttum (Os EO), tutti gli altri quattro oli essenziali analizzati hanno mostrato evidenti effetti allercici, con valori di LC50 compresi tra 23,37 e 120,16 ppm nell'arco di 24 ore di esposizione. L'olio essenziale di Thymophilus striata (Cl EO) è risultato il più efficace nell'uccidere gli adulti, con un valore di LC50 di 23,37 ppm entro 24 ore dall'esposizione, seguito da quello di Eucalyptus maculata (Em) con un valore di LC50 di 101,91 ppm (Tabella 1). D'altra parte, il valore di LC50 per Os non è ancora stato determinato, poiché il tasso di mortalità più elevato, pari al 53%, è stato registrato alla dose più alta (Figura supplementare 3).
I due principali composti costituenti in ciascun EO sono stati identificati e selezionati in base ai risultati del database della libreria NIST, alla percentuale dell'area del cromatogramma GC e ai risultati degli spettri MS (Tabella 2). Per l'EO As, i principali composti identificati erano disolfuro di diallile e trisolfuro di diallile; per l'EO Mp i principali composti identificati erano carvone e limonene, per l'EO Em i principali composti identificati erano eudesmolo ed eucaliptolo; per l'EO Os, i principali composti identificati erano eugenolo e metil eugenolo, e per l'EO Cl, i principali composti identificati erano eugenolo e α-pinene (Figura 1, Figure supplementari 5-8, Tabelle supplementari 1-5).
Risultati della spettrometria di massa dei principali terpenoidi di oli essenziali selezionati (A-diallil disolfuro; B-diallil trisolfuro; C-eugenolo; D-metil eugenolo; E-limonene; F-ceperone aromatico; G-α-pinene; H-cineolo; R-eudamolo).
Sono stati identificati nove composti (disolfuro di diallile, trisolfuro di diallile, eugenolo, metil eugenolo, carvone, limonene, eucaliptolo, eudesmolo, α-pinene) come componenti principali dell'olio essenziale e sono stati testati individualmente contro Aedes aegypti allo stadio larvale. Il composto eudesmolo ha mostrato la più alta attività larvicida con un valore di LC50 di 2,25 ppm dopo 24 ore di esposizione. Anche i composti disolfuro di diallile e trisolfuro di diallile hanno mostrato potenziali effetti larvicidi, con dosi subletali medie comprese tra 10 e 20 ppm. Un'attività larvicida moderata è stata osservata anche per i composti eugenolo, limonene ed eucaliptolo con valori di LC50 rispettivamente di 63,35 ppm e 139,29 ppm. e 181,33 ppm dopo 24 ore, rispettivamente (Tabella 3). Tuttavia, non è stato riscontrato alcun potenziale larvicida significativo del metil eugenolo e del carvone nemmeno alle dosi più elevate, quindi i valori di LC50 non sono stati calcolati (Tabella 3). Il larvicida sintetico Temephos ha avuto una concentrazione letale media di 0,43 ppm contro Aedes aegypti in 24 ore di esposizione (Tabella 3, Tabella supplementare 6).
Sette composti (disolfuro di diallile, trisolfuro di diallile, eucaliptolo, α-pinene, eudesmolo, limonene e carvone) sono stati identificati come i principali composti dell'olio essenziale efficace e sono stati testati individualmente contro zanzare Aedes egiziane adulte. Secondo l'analisi di regressione Probit, l'eudesmolo ha mostrato il potenziale più elevato con un valore di LC50 di 1,82 ppm, seguito dall'eucaliptolo con un valore di LC50 di 17,60 ppm dopo 24 ore di esposizione. I restanti cinque composti testati sono risultati moderatamente dannosi per gli adulti con valori di LC50 compresi tra 140,79 e 737,01 ppm (Tabella 3). Il malathion, un organofosforico sintetico, è risultato meno potente dell'eudesmolo e più potente degli altri sei composti, con un valore di LC50 di 5,44 ppm nel periodo di esposizione di 24 ore (Tabella 3, Tabella supplementare 6).
Sette potenti composti di piombo e l'organofosforico tamefosato sono stati selezionati per formulare combinazioni binarie delle loro dosi LC50 in rapporto 1:1. Sono state preparate e testate in totale 28 combinazioni binarie per la loro efficacia larvicida contro Aedes aegypti. Nove combinazioni sono risultate sinergiche, 14 antagoniste e cinque non larvicide. Tra le combinazioni sinergiche, la combinazione di diallil disolfuro e temofol è risultata la più efficace, con una mortalità del 100% osservata dopo 24 ore (Tabella 4). Analogamente, le miscele di limonene con diallil disolfuro ed eugenolo con timetfos hanno mostrato un buon potenziale con una mortalità larvale osservata del 98,3% (Tabella 5). Le restanti 4 combinazioni, vale a dire eudesmolo più eucaliptolo, eudesmolo più limonene, eucaliptolo più alfa-pinene, alfa-pinene più temefos, hanno mostrato anch'esse una significativa efficacia larvicida, con tassi di mortalità osservati superiori al 90%. Il tasso di mortalità previsto è vicino al 60-75% (Tabella 4). Tuttavia, la combinazione di limonene con α-pinene o eucalipto ha mostrato reazioni antagoniste. Allo stesso modo, è stato riscontrato che le miscele di temefos con eugenolo o eucalipto o eudesmolo o diallil trisolfuro hanno effetti antagonisti. Analogamente, la combinazione di diallil disolfuro e diallil trisolfuro e la combinazione di uno qualsiasi di questi composti con eudesmolo o eugenolo sono antagoniste nella loro azione larvicida. Antagonismo è stato segnalato anche con la combinazione di eudesmolo con eugenolo o α-pinene.
Di tutte le 28 miscele binarie testate per l'attività acida sugli adulti, 7 combinazioni sono risultate sinergiche, 6 non hanno avuto alcun effetto e 15 sono risultate antagonistiche. Le miscele di eudesmolo con eucalipto e di limonene con carvone si sono dimostrate più efficaci rispetto ad altre combinazioni sinergiche, con tassi di mortalità a 24 ore rispettivamente del 76% e del 100% (Tabella 5). È stato osservato che il malatione presenta un effetto sinergico con tutte le combinazioni di composti, ad eccezione del limonene e del trisolfuro di diallile. D'altra parte, è stato riscontrato antagonismo tra il disolfuro di diallile e il trisolfuro di diallile e la combinazione di entrambi con eucalipto, eucaliptolo, carvone o limonene. Analogamente, le combinazioni di α-pinene con eudesmolo o limonene, eucaliptolo con carvone o limonene e limonene con eudesmolo o malathion hanno mostrato effetti larvicidi antagonistici. Per le restanti sei combinazioni, non vi è stata alcuna differenza significativa tra la mortalità prevista e quella osservata (Tabella 5).
Sulla base degli effetti sinergici e delle dosi subletali, la loro tossicità larvicida contro un gran numero di zanzare Aedes aegypti è stata infine selezionata e ulteriormente testata. I risultati hanno mostrato che la mortalità larvale osservata utilizzando le combinazioni binarie eugenolo-limonene, diallil disolfuro-limonene e diallil disolfuro-timefos era del 100%, mentre la mortalità larvale prevista era rispettivamente del 76,48%, 72,16% e 63,4% (Tabella 6). La combinazione di limonene ed eudesmolo è risultata relativamente meno efficace, con una mortalità larvale dell'88% osservata nel periodo di esposizione di 24 ore (Tabella 6). In sintesi, le quattro combinazioni binarie selezionate hanno anche dimostrato effetti larvicidi sinergici contro Aedes aegypti se applicate su larga scala (Tabella 6).
Sono state selezionate tre combinazioni sinergiche per il bioassay adultocida al fine di controllare grandi popolazioni di Aedes aegypti adulti. Per selezionare le combinazioni da testare su grandi colonie di insetti, ci siamo inizialmente concentrati sulle due migliori combinazioni sinergiche di terpeni, ovvero carvone più limonene ed eucaliptolo più eudesmolo. In secondo luogo, la migliore combinazione sinergica è stata selezionata tra la combinazione di malathion, un organofosfato sintetico, e terpenoidi. Riteniamo che la combinazione di malathion ed eudesmolo sia la migliore per i test su grandi colonie di insetti, grazie alla più alta mortalità osservata e ai valori di LC50 molto bassi dei componenti candidati. Il malathion mostra sinergismo in combinazione con α-pinene, diallil disolfuro, eucalipto, carvone ed eudesmolo. Tuttavia, se consideriamo i valori di LC50, l'eudesmolo presenta il valore più basso (2,25 ppm). I valori LC50 calcolati di malathion, α-pinene, diallil disolfuro, eucaliptolo e carvone erano rispettivamente 5,4, 716,55, 166,02, 17,6 e 140,79 ppm. Questi valori indicano che la combinazione di malathion ed eudesmolo è la combinazione ottimale in termini di dosaggio. I risultati hanno mostrato che le combinazioni di carvone più limonene ed eudesmolo più malathion hanno avuto una mortalità osservata del 100% rispetto a una mortalità prevista del 61%-65%. Un'altra combinazione, eudesmolo più eucaliptolo, ha mostrato un tasso di mortalità del 78,66% dopo 24 ore di esposizione, rispetto a un tasso di mortalità previsto del 60%. Tutte e tre le combinazioni selezionate hanno dimostrato effetti sinergici anche se applicate su larga scala contro Aedes aegypti adulti (Tabella 6).
In questo studio, alcuni oli essenziali vegetali selezionati, come Mp, As, Os, Em e Cl, hanno mostrato promettenti effetti letali sugli stadi larvali e adulti di Aedes aegypti. L'olio essenziale di Mp ha mostrato la più alta attività larvicida con un valore di LC50 di 0,42 ppm, seguito dagli oli essenziali di As, Os ed Em con un valore di LC50 inferiore a 50 ppm dopo 24 ore. Questi risultati sono coerenti con studi precedenti su zanzare e altri ditteri10,11,12,13,14. Sebbene la potenza larvicida di Cl sia inferiore a quella degli altri oli essenziali, con un valore di LC50 di 163,65 ppm dopo 24 ore, il suo potenziale sugli adulti è il più elevato con un valore di LC50 di 23,37 ppm dopo 24 ore. Gli oli essenziali Mp, As ed Em hanno mostrato anche un buon potenziale allercico con valori di LC50 compresi tra 100 e 120 ppm a 24 ore di esposizione, ma relativamente inferiori alla loro efficacia larvicida. D'altra parte, l'olio essenziale Os ha dimostrato un effetto allercico trascurabile anche alla dose terapeutica più elevata. Pertanto, i risultati indicano che la tossicità dell'ossido di etilene per le piante può variare a seconda dello stadio di sviluppo delle zanzare15. Dipende anche dalla velocità di penetrazione degli oli essenziali nel corpo dell'insetto, dalla loro interazione con specifici enzimi bersaglio e dalla capacità di detossificazione della zanzara in ogni stadio di sviluppo16. Un gran numero di studi ha dimostrato che il composto principale è un fattore importante nell'attività biologica dell'ossido di etilene, poiché rappresenta la maggior parte dei composti totali3,12,17,18. Pertanto, abbiamo considerato due composti principali in ciascun olio essenziale. Sulla base dei risultati GC-MS, il diallil disolfuro e il diallil trisolfuro sono stati identificati come i principali composti dell'olio essenziale di As, il che è coerente con precedenti rapporti19,20,21. Sebbene precedenti rapporti indicassero che il mentolo fosse uno dei suoi principali composti, il carvone e il limonene sono stati nuovamente identificati come i principali composti dell'olio essenziale di Mp22,23. Il profilo di composizione dell'olio essenziale di Os ha mostrato che l'eugenolo e il metil eugenolo sono i principali composti, il che è simile ai risultati di precedenti ricercatori16,24. L'eucaliptolo e l'eucaliptolo sono stati segnalati come i principali composti presenti nell'olio di foglie di Em, il che è coerente con i risultati di alcuni ricercatori25,26 ma contrario ai risultati di Olalade et al.27. La predominanza di cineolo e α-pinene è stata osservata nell'olio essenziale di melaleuca, il che è simile a studi precedenti28,29. Sono state segnalate differenze intraspecifiche nella composizione e concentrazione di oli essenziali estratti dalla stessa specie vegetale in diverse località, e sono state osservate anche in questo studio, influenzate dalle condizioni geografiche di crescita della pianta, dal momento della raccolta, dallo stadio di sviluppo o dall'età della pianta, dalla comparsa di chemiotipi, ecc.22,30,31,32. I composti chiave identificati sono stati quindi acquistati e testati per i loro effetti larvicidi e per gli effetti sulle zanzare adulte Aedes aegypti. I risultati hanno mostrato che l'attività larvicida del disolfuro di diallile era paragonabile a quella dell'olio essenziale grezzo As. Ma l'attività del trisolfuro di diallile è superiore a quella dell'olio essenziale As. Questi risultati sono simili a quelli ottenuti da Kimbaris et al. 33 su Culex philippines. Tuttavia, questi due composti non hanno mostrato una buona attività autocida contro le zanzare bersaglio, il che è coerente con i risultati di Plata-Rueda et al. 34 su Tenebrio molitor. L'ossido di etilene (Os EO) è efficace contro lo stadio larvale di Aedes aegypti, ma non contro lo stadio adulto. È stato stabilito che l'attività larvicida dei principali composti individuali è inferiore a quella dell'Os EO grezzo. Ciò implica un ruolo per altri composti e le loro interazioni nell'ossido di etilene grezzo. Il metil eugenolo da solo ha un'attività trascurabile, mentre l'eugenolo da solo ha un'attività larvicida moderata. Questa conclusione conferma, da un lato,35,36 e dall'altro contraddice le conclusioni di precedenti ricercatori37,38. Le differenze nei gruppi funzionali dell'eugenolo e del metil eugenolo possono comportare tossicità diverse per lo stesso insetto bersaglio39. È stato riscontrato che il limonene ha un'attività larvicida moderata, mentre l'effetto del carvone è stato insignificante. Allo stesso modo, la tossicità relativamente bassa del limonene per gli insetti adulti e l'elevata tossicità del carvone supportano i risultati di alcuni studi precedenti40 ma ne contraddicono altri41. La presenza di doppi legami sia in posizione intraciclica che esociclica può aumentare i benefici di questi composti come larvicidi3,41, mentre il carvone, che è un chetone con carboni alfa e beta insaturi, può mostrare un potenziale di tossicità maggiore negli adulti42. Tuttavia, le caratteristiche individuali del limonene e del carvone sono molto inferiori rispetto all'EO Mp totale (Tabella 1, Tabella 3). Tra i terpenoidi testati, l'eudesmolo ha mostrato la maggiore attività larvicida e sugli adulti con un valore di LC50 inferiore a 2,5 ppm, rendendolo un composto promettente per il controllo delle zanzare Aedes. Le sue prestazioni sono migliori di quelle dell'intero EO Em, sebbene ciò non sia coerente con i risultati di Cheng et al.40. L'eudesmolo è un sesquiterpene con due unità isopreniche che è meno volatile dei monoterpeni ossigenati come l'eucalipto e quindi ha un maggiore potenziale come pesticida. L'eucaliptolo stesso ha un'attività larvicida maggiore sugli adulti rispetto a quella larvicida, e i risultati di studi precedenti supportano e confutano questa affermazione37,43,44. La sua attività da sola è quasi paragonabile a quella dell'intero EO Cl. Un altro monoterpene biciclico, l'α-pinene, ha un effetto larvicida minore sugli adulti di Aedes aegypti, il che è l'opposto dell'effetto dell'intero EO Cl. L'attività insetticida complessiva dei terpenoidi è influenzata dalla loro lipofilia, volatilità, ramificazione del carbonio, area di proiezione, area superficiale, gruppi funzionali e loro posizione45,46. Questi composti possono agire distruggendo gli accumuli cellulari, bloccando l'attività respiratoria, interrompendo la trasmissione degli impulsi nervosi, ecc.47 È stato riscontrato che l'organofosfato sintetico Temephos ha la più alta attività larvicida con un valore di LC50 di 0,43 ppm, che è coerente con i dati di Lek-Utala48. L'attività negli adulti del malathion, un organofosfato sintetico, è stata riportata a 5,44 ppm. Sebbene questi due organofosfati abbiano mostrato risposte favorevoli contro i ceppi di laboratorio di Aedes aegypti, la resistenza delle zanzare a questi composti è stata segnalata in diverse parti del mondo49. Tuttavia, non sono stati trovati rapporti simili sullo sviluppo di resistenza ai medicinali a base di erbe50. Pertanto, i prodotti botanici sono considerati potenziali alternative ai pesticidi chimici nei programmi di controllo dei vettori.
L'effetto larvicida è stato testato su 28 combinazioni binarie (1:1) preparate da terpenoidi potenti e terpenoidi con timetfos, e 9 combinazioni sono risultate sinergiche, 14 antagoniste e 5 antagoniste. Nessun effetto. D'altra parte, nel bioassay di potenza sugli adulti, 7 combinazioni sono risultate sinergiche, 15 antagoniste e 6 non hanno avuto alcun effetto. Il motivo per cui alcune combinazioni producono un effetto sinergico può essere dovuto all'interazione simultanea dei composti candidati in diversi percorsi importanti, o all'inibizione sequenziale di diversi enzimi chiave di un particolare percorso biologico51. La combinazione di limonene con diallil disolfuro, eucalipto o eugenolo è risultata sinergica sia in applicazioni su piccola che su larga scala (Tabella 6), mentre la sua combinazione con eucalipto o α-pinene ha mostrato effetti antagonisti sulle larve. In media, il limonene sembra essere un buon sinergizzante, probabilmente a causa della presenza di gruppi metilici, della buona penetrazione nello strato corneo e di un diverso meccanismo d'azione52,53. È stato precedentemente riportato che il limonene può causare effetti tossici penetrando le cuticole degli insetti (tossicità da contatto), influenzando il sistema digerente (antifedante) o influenzando il sistema respiratorio (attività di fumigazione),54 mentre i fenilpropanoidi come l'eugenolo possono influenzare gli enzimi metabolici55. Pertanto, le combinazioni di composti con diversi meccanismi d'azione possono aumentare l'effetto letale complessivo della miscela. È stato scoperto che l'eucaliptolo è sinergico con il disolfuro di diallile, l'eucalipto o l'α-pinene, ma altre combinazioni con altri composti sono risultate non larvicide o antagonistiche. Studi precedenti hanno dimostrato che l'eucaliptolo ha attività inibitoria sull'acetilcolinesterasi (AChE), nonché sui recettori dell'octamina e del GABA56. Poiché i monoterpeni ciclici, l'eucaliptolo, l'eugenolo, ecc. possono avere lo stesso meccanismo d'azione della loro attività neurotossica, 57 minimizzando così i loro effetti combinati attraverso l'inibizione reciproca. Allo stesso modo, la combinazione di Temephos con diallil disolfuro, α-pinene e limonene si è rivelata sinergica, supportando precedenti segnalazioni di un effetto sinergico tra prodotti erboristici e organofosfati sintetici58.
È stato riscontrato che la combinazione di eudesmolo ed eucaliptolo ha un effetto sinergico sugli stadi larvali e adulti di Aedes aegypti, probabilmente a causa delle loro diverse modalità d'azione dovute alle loro diverse strutture chimiche. L'eudesmolo (un sesquiterpene) può influenzare il sistema respiratorio 59 e l'eucaliptolo (un monoterpene) può influenzare l'acetilcolinesterasi 60. La co-esposizione degli ingredienti a due o più siti bersaglio può aumentare l'effetto letale complessivo della combinazione. Nei bioassay di sostanze adulte, il malathion è risultato sinergico con carvone o eucaliptolo o eucaliptolo o disolfuro di diallile o α-pinene, indicando che è sinergico con l'aggiunta di limonene e di. Buoni candidati allercidi sinergici per l'intero portfolio di composti terpenici, con l'eccezione del trisolfuro di allile. Thangam e Kathiresan61 hanno riportato risultati simili sull'effetto sinergico del malathion con estratti vegetali. Questa risposta sinergica potrebbe essere dovuta agli effetti tossici combinati del malathion e dei fitochimici sugli enzimi detossificanti degli insetti. Gli organofosfati come il malathion agiscono generalmente inibendo le esterasi del citocromo P450 e le monoossigenasi62,63,64. Pertanto, la combinazione del malathion con questi meccanismi d'azione e dei terpeni con meccanismi d'azione diversi potrebbe potenziare l'effetto letale complessivo sulle zanzare.
D'altra parte, l'antagonismo indica che i composti selezionati sono meno attivi in combinazione rispetto a ciascun composto preso singolarmente. La ragione dell'antagonismo in alcune combinazioni può essere che un composto modifica il comportamento dell'altro, alterando la velocità di assorbimento, distribuzione, metabolismo o escrezione. I primi ricercatori consideravano questa la causa dell'antagonismo nelle combinazioni di farmaci. Molecole Possibile meccanismo 65. Allo stesso modo, le possibili cause dell'antagonismo possono essere correlate a meccanismi d'azione simili, alla competizione dei composti costituenti per lo stesso recettore o sito bersaglio. In alcuni casi, può verificarsi anche un'inibizione non competitiva della proteina bersaglio. In questo studio, due composti organosolforati, il diallil disolfuro e il diallil trisolfuro, hanno mostrato effetti antagonistici, probabilmente a causa della competizione per lo stesso sito bersaglio. Analogamente, questi due composti solforati hanno mostrato effetti antagonistici e non hanno avuto alcun effetto se combinati con eudesmolo e α-pinene. L'eudesmolo e l'alfa-pinene sono di natura ciclica, mentre il diallil disolfuro e il diallil trisolfuro sono di natura alifatica. In base alla struttura chimica, la combinazione di questi composti dovrebbe aumentare l'attività letale complessiva poiché i loro siti bersaglio sono solitamente diversi34,47, ma sperimentalmente abbiamo riscontrato antagonismo, che potrebbe essere dovuto al ruolo di questi composti in alcuni organismi sconosciuti in vivo. sistemi come risultato dell'interazione. Allo stesso modo, la combinazione di cineolo e α-pinene ha prodotto risposte antagonistiche, sebbene i ricercatori abbiano precedentemente riportato che i due composti hanno bersagli d'azione diversi47,60. Poiché entrambi i composti sono monoterpeni ciclici, potrebbero esserci alcuni siti bersaglio comuni che possono competere per il legame e influenzare la tossicità complessiva delle coppie combinatorie studiate.
Sulla base dei valori di LC50 e della mortalità osservata, sono state selezionate le due migliori combinazioni sinergiche di terpeni, ovvero le coppie carvone + limonene ed eucaliptolo + eudesmolo, nonché il malathion organofosforico sintetico con terpeni. La combinazione sinergica ottimale di malathion + eudesmolo è stata testata in un bioassay insetticida su adulti. È stato preso di mira un gran numero di colonie di insetti per confermare se queste combinazioni efficaci possano agire contro un elevato numero di individui in spazi di esposizione relativamente ampi. Tutte queste combinazioni hanno dimostrato un effetto sinergico contro grandi sciami di insetti. Risultati simili sono stati ottenuti per una combinazione larvicida sinergica ottimale testata contro grandi popolazioni di larve di Aedes aegypti. Pertanto, si può affermare che l'efficace combinazione sinergica larvicida e adulticida di composti di oli essenziali vegetali è un valido candidato rispetto agli attuali prodotti chimici sintetici e può essere ulteriormente utilizzata per il controllo delle popolazioni di Aedes aegypti. Analogamente, combinazioni efficaci di larvicidi o adulticidi sintetici con terpeni possono essere utilizzate anche per ridurre le dosi di timetfos o malatione somministrate alle zanzare. Queste potenti combinazioni sinergiche potrebbero fornire soluzioni per futuri studi sull'evoluzione della resistenza ai farmaci nelle zanzare Aedes.
Le uova di Aedes aegypti sono state raccolte dal Regional Medical Research Centre, Dibrugarh, Indian Council of Medical Research e mantenute a temperatura controllata (28 ± 1 °C) e umidità (85 ± 5%) nel Dipartimento di Zoologia, Gauhati University nelle seguenti condizioni: Arivoli sono stati descritti et al. Dopo la schiusa, le larve sono state nutrite con cibo larvale (polvere di biscotti per cani e lievito in rapporto 3:1) e gli adulti con una soluzione di glucosio al 10%. A partire dal 3° giorno dopo l'emergenza, alle zanzare femmine adulte è stato permesso di succhiare il sangue di ratti albini. Immergere la carta da filtro in acqua in un bicchiere e posizionarla nella gabbia per la deposizione delle uova.
Campioni selezionati di piante, ovvero foglie di eucalipto (Myrtaceae), basilico sacro (Lamiaceae), menta (Lamiaceae), melaleuca (Myrtaceae) e bulbi di allium (Amaryllidaceae), sono stati raccolti a Guwahati e identificati dal Dipartimento di Botanica dell'Università di Gauhati. I campioni vegetali raccolti (500 g) sono stati sottoposti a idrodistillazione utilizzando un apparecchio Clevenger per 6 ore. L'olio essenziale estratto è stato raccolto in fiale di vetro pulite e conservato a 4 °C per ulteriori studi.
La tossicità larvicida è stata studiata utilizzando procedure standard dell'Organizzazione Mondiale della Sanità leggermente modificate 67. Utilizzare DMSO come emulsionante. Ogni concentrazione di EO è stata inizialmente testata a 100 e 1000 ppm, esponendo 20 larve in ogni replica. In base ai risultati, è stato applicato un intervallo di concentrazione e la mortalità è stata registrata da 1 ora a 6 ore (a intervalli di 1 ora), e a 24 ore, 48 ore e 72 ore dopo il trattamento. Le concentrazioni subletali (LC50) sono state determinate dopo 24, 48 e 72 ore di esposizione. Ogni concentrazione è stata testata in triplicato insieme a un controllo negativo (solo acqua) e un controllo positivo (acqua trattata con DMSO). Se si verifica la pupazione e più del 10% delle larve del gruppo di controllo muore, l'esperimento viene ripetuto. Se il tasso di mortalità nel gruppo di controllo è compreso tra il 5 e il 10%, utilizzare la formula di correzione di Abbott 68.
Il metodo descritto da Ramar et al. 69 è stato utilizzato per un bioassay su zanzare adulte di Aedes aegypti utilizzando acetone come solvente. Ciascun olio essenziale è stato inizialmente testato su zanzare adulte di Aedes aegypti a concentrazioni di 100 e 1000 ppm. Applicare 2 ml di ciascuna soluzione preparata su un pezzo di carta da filtro (dimensioni 12 x 15 cm2) e lasciare evaporare l'acetone per 10 minuti. La carta da filtro trattata con soli 2 ml di acetone è stata utilizzata come controllo. Dopo l'evaporazione dell'acetone, la carta da filtro trattata e la carta da filtro di controllo sono state poste in un tubo cilindrico (profondità 10 cm). Dieci zanzare di 3-4 giorni di età, non ematofaghe, sono state trasferite in triplicato per ciascuna concentrazione. Sulla base dei risultati dei test preliminari, sono state testate diverse concentrazioni degli oli selezionati. La mortalità è stata registrata a 1 ora, 2 ore, 3 ore, 4 ore, 5 ore, 6 ore, 24 ore, 48 ore e 72 ore dopo il rilascio delle zanzare. Calcolare i valori di LC50 per tempi di esposizione di 24 ore, 48 ore e 72 ore. Se il tasso di mortalità del lotto di controllo supera il 20%, ripetere l'intero test. Analogamente, se il tasso di mortalità nel gruppo di controllo è superiore al 5%, correggere i risultati per i campioni trattati utilizzando la formula di Abbott68.
Per analizzare i composti costituenti degli oli essenziali selezionati sono state utilizzate la gascromatografia (Agilent 7890A) e la spettrometria di massa (Accu TOF GCv, Jeol). Il gascromatografo era dotato di un rivelatore FID e di una colonna capillare (HP5-MS). Il gas vettore era elio, con una portata di 1 ml/min. Il programma GC imposta Allium sativum a 10:80-1M-8-220-5M-8-270-9M e Ocimum Sainttum a 10:80-3M-8-200-3M-10-275-1M-5 – 280, per la menta 10:80-1M-8-200-5M-8-275-1M-5-280, per l'eucalipto 20.60-1M-10-200-3M-30-280 e per il rosso Per mille strati sono loro 10: 60-1M-8-220-5M-8-270-3M.
I principali composti di ciascun olio essenziale sono stati identificati in base alla percentuale di area calcolata dal cromatogramma GC e dai risultati della spettrometria di massa (con riferimento al database degli standard NIST 70).
I due composti principali di ciascun olio essenziale sono stati selezionati in base ai risultati della GC-MS e acquistati da Sigma-Aldrich con una purezza del 98-99% per ulteriori saggi biologici. I composti sono stati testati per l'efficacia larvicida e contro gli adulti di Aedes aegypti, come descritto in precedenza. I larvicidi sintetici più comunemente utilizzati, tamefosato (Sigma Aldrich) e malathion (Sigma Aldrich), sono stati analizzati per confrontarne l'efficacia con i composti selezionati degli oli essenziali, seguendo la stessa procedura.
Sono state preparate miscele binarie di composti terpenici selezionati e di composti terpenici più organofosfati commerciali (tilefos e malathion) miscelando la dose LC50 di ciascun composto candidato in un rapporto 1:1. Le combinazioni preparate sono state testate sugli stadi larvali e adulti di Aedes aegypti come descritto in precedenza. Ogni bioassay è stato eseguito in triplicato per ogni combinazione e in triplicato per i singoli composti presenti in ciascuna combinazione. La morte degli insetti bersaglio è stata registrata dopo 24 ore. Calcolare il tasso di mortalità previsto per una miscela binaria utilizzando la seguente formula.
dove E = tasso di mortalità previsto delle zanzare Aedes aegypti in risposta a una combinazione binaria, ovvero la connessione (A + B).
L'effetto di ciascuna miscela binaria è stato etichettato come sinergico, antagonista o nullo in base al valore χ2 calcolato con il metodo descritto da Pavla52. Calcola il valore χ2 per ciascuna combinazione utilizzando la seguente formula.
L'effetto di una combinazione è stato definito sinergico quando il valore di χ² calcolato era maggiore del valore di tabella per i corrispondenti gradi di libertà (intervallo di confidenza al 95%) e se la mortalità osservata risultava superiore alla mortalità attesa. Analogamente, se il valore di χ² calcolato per una qualsiasi combinazione supera il valore di tabella con alcuni gradi di libertà, ma la mortalità osservata è inferiore alla mortalità attesa, il trattamento è considerato antagonista. Infine, se in una qualsiasi combinazione il valore di χ² calcolato è inferiore al valore di tabella nei corrispondenti gradi di libertà, la combinazione è considerata priva di effetto.
Sono state selezionate da tre a quattro combinazioni potenzialmente sinergiche (100 larve e 50 attività larvicida e sugli insetti adulti) per i test su un gran numero di insetti. Gli adulti sono stati testati come descritto in precedenza. Oltre alle miscele, i singoli composti presenti nelle miscele selezionate sono stati testati anche su un numero uguale di larve e adulti di Aedes aegypti. Il rapporto di combinazione è di una parte di dose LC50 di un composto candidato e una parte di dose LC50 dell'altro composto costituente. Nel bioassay sull'attività sugli adulti, i composti selezionati sono stati disciolti nel solvente acetone e applicati su carta da filtro avvolta in un contenitore cilindrico di plastica da 1300 cm³. L'acetone è stato fatto evaporare per 10 minuti e gli adulti sono stati rilasciati. Analogamente, nel bioassay larvicida, le dosi dei composti candidati LC50 sono state prima disciolte in volumi uguali di DMSO e poi mescolate con 1 litro di acqua conservata in contenitori di plastica da 1300 cc, e le larve sono state rilasciate.
È stata eseguita un'analisi probabilistica di 71 dati di mortalità registrati utilizzando i software SPSS (versione 16) e Minitab per calcolare i valori di LC50.
Data di pubblicazione: 1 luglio 2024