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Le combinazioni di composti insetticidi di origine vegetale possono mostrare interazioni sinergiche o antagoniste contro i parassiti. Data la rapida diffusione di malattie trasmesse dalle zanzare Aedes e la crescente resistenza delle popolazioni di zanzare Aedes agli insetticidi tradizionali, sono state formulate e testate ventotto combinazioni di composti terpenici a base di oli essenziali vegetali contro gli stadi larvali e adulti di Aedes aegypti. Inizialmente sono stati valutati cinque oli essenziali vegetali (OE) per la loro efficacia larvicida e per l'uso su adulti, e due composti principali sono stati identificati in ciascun OE sulla base dei risultati della GC-MS. I principali composti identificati sono stati acquistati, ovvero diallil disolfuro, diallil trisolfuro, carvone, limonene, eugenolo, metil eugenolo, eucaliptolo, eudesmolo e alfa-pinene delle zanzare. Combinazioni binarie di questi composti sono state quindi preparate utilizzando dosi subletali e i loro effetti sinergici e antagonisti sono stati testati e determinati. Le migliori composizioni larvicide si ottengono miscelando limonene con disolfuro di diallile, mentre le migliori composizioni adulticide si ottengono miscelando carvone con limonene. Il larvicida sintetico commerciale Temphos e il farmaco per adulti Malathion sono stati testati separatamente e in combinazioni binarie con terpenoidi. I risultati hanno dimostrato che la combinazione di temephos e disolfuro di diallile e di malathion ed eudesmolo è stata la più efficace. Queste potenti combinazioni presentano un potenziale d'uso contro Aedes aegypti.
Gli oli essenziali vegetali (EO) sono metaboliti secondari contenenti vari composti bioattivi e stanno diventando sempre più importanti come alternativa ai pesticidi sintetici. Non solo sono ecocompatibili e facili da usare, ma sono anche una miscela di diversi composti bioattivi, il che riduce anche la probabilità di sviluppare resistenza ai farmaci1. Utilizzando la tecnologia GC-MS, i ricercatori hanno esaminato i costituenti di vari oli essenziali vegetali e hanno identificato oltre 3.000 composti da 17.500 piante aromatiche2, la maggior parte dei quali è stata testata per le proprietà insetticide e si ritiene abbia effetti insetticidi3,4. Alcuni studi evidenziano che la tossicità del componente principale del composto è uguale o superiore a quella del suo ossido di etilene grezzo. Tuttavia, l'uso di singoli composti può ancora una volta lasciare spazio allo sviluppo di resistenza, come nel caso degli insetticidi chimici5,6. Pertanto, l'attenzione attuale è rivolta alla preparazione di miscele di composti a base di ossido di etilene per migliorare l'efficacia insetticida e ridurre la probabilità di resistenza nelle popolazioni di parassiti target. I singoli composti attivi presenti negli oli essenziali possono mostrare effetti sinergici o antagonisti in combinazioni che riflettono l'attività complessiva dell'olio essenziale, un fatto che è stato ampiamente sottolineato in studi condotti da ricercatori precedenti7,8. Il programma di controllo dei vettori include anche l'olio essenziale e i suoi componenti. L'attività zanzarocida degli oli essenziali è stata ampiamente studiata sulle zanzare Culex e Anopheles. Diversi studi hanno tentato di sviluppare pesticidi efficaci combinando varie piante con pesticidi sintetici commerciali per aumentare la tossicità complessiva e minimizzare gli effetti collaterali9. Tuttavia, gli studi su tali composti contro Aedes aegypti rimangono rari. I progressi della scienza medica e lo sviluppo di farmaci e vaccini hanno contribuito a combattere alcune malattie trasmesse da vettori. Tuttavia, la presenza di diversi sierotipi del virus, trasmesso dalla zanzara Aedes aegypti, ha portato al fallimento dei programmi di vaccinazione. Pertanto, quando si verificano tali malattie, i programmi di controllo dei vettori sono l'unica opzione per prevenirne la diffusione. Nello scenario attuale, il controllo di Aedes aegypti è molto importante in quanto è un vettore chiave di vari virus e dei loro sierotipi che causano la febbre dengue, Zika, febbre emorragica dengue, febbre gialla, ecc. L'aspetto più degno di nota è il fatto che il numero di casi di quasi tutte le malattie trasmesse da vettori di Aedes aumenta ogni anno in Egitto e in tutto il mondo. Pertanto, in questo contesto, vi è un'urgente necessità di sviluppare misure di controllo ecocompatibili ed efficaci per le popolazioni di Aedes aegypti. Potenziali candidati a questo proposito sono gli oli essenziali (OE), i loro composti costituenti e le loro combinazioni. Pertanto, questo studio ha cercato di identificare combinazioni sinergiche efficaci di composti chiave di OE vegetali da cinque piante con proprietà insetticide (ovvero menta, basilico santo, eucalipto maculato, Allium sulphur e melaleuca) contro Aedes aegypti.
Tutti gli oli essenziali selezionati hanno dimostrato una potenziale attività larvicida contro Aedes aegypti con una LC50 a 24 ore compresa tra 0,42 e 163,65 ppm. L'attività larvicida più elevata è stata registrata per l'olio essenziale di menta piperita (Mp) con una LC50 di 0,42 ppm a 24 ore, seguita dall'aglio (As) con una LC50 di 16,19 ppm a 24 ore (Tabella 1).
Ad eccezione di Ocimum Sainttum, Os EO, tutti gli altri quattro EO analizzati hanno mostrato evidenti effetti allercidi, con valori di LC50 compresi tra 23,37 e 120,16 ppm nel periodo di esposizione di 24 ore. L'EO di Thymophilus striata (Cl) è risultato il più efficace nell'uccidere gli adulti con un valore di LC50 di 23,37 ppm entro 24 ore dall'esposizione, seguito da Eucalyptus maculata (Em) con un valore di LC50 di 101,91 ppm (Tabella 1). D'altra parte, il valore di LC50 per Os non è stato ancora determinato, poiché il tasso di mortalità più elevato, pari al 53%, è stato registrato alla dose più elevata (Figura supplementare 3).
I due principali composti costituenti di ciascun EO sono stati identificati e selezionati in base ai risultati del database NIST, alla percentuale di area del cromatogramma GC e ai risultati degli spettri MS (Tabella 2). Per l'EO As, i principali composti identificati sono stati il diallil disolfuro e il diallil trisolfuro; per l'EO Mp i principali composti identificati sono stati il carvone e il limonene, per l'EO Em i principali composti identificati sono stati l'eudesmolo e l'eucaliptolo; per l'EO Os, i principali composti identificati sono stati l'eugenolo e il metil eugenolo, e per l'EO Cl, i principali composti identificati sono stati l'eugenolo e l'α-pinene (Figura 1, Figure supplementari 5–8, Tabella supplementare 1–5).
Risultati della spettrometria di massa dei principali terpenoidi di oli essenziali selezionati (A-disolfuro di diallile; B-trisolfuro di diallile; C-eugenolo; D-metil eugenolo; E-limonene; F-ceperone aromatico; G-α-pinene; H-cineolo; R-eudamolo).
Un totale di nove composti (disolfuro di diallile, trisolfuro di diallile, eugenolo, metil eugenolo, carvone, limonene, eucaliptolo, eudesmolo, α-pinene) sono stati identificati come composti efficaci, componenti principali dell'EO, e sono stati biodosati individualmente contro Aedes aegypti allo stadio larvale. Il composto eudesmolo ha mostrato la più elevata attività larvicida, con un valore di LC50 di 2,25 ppm dopo 24 ore di esposizione. Anche i composti disolfuro di diallile e trisolfuro di diallile hanno potenziali effetti larvicidi, con dosi subletali medie comprese tra 10 e 20 ppm. Un'attività larvicida moderata è stata nuovamente osservata per i composti eugenolo, limonene ed eucaliptolo, con valori di LC50 di 63,35 ppm e 139,29 ppm. e 181,33 ppm dopo 24 ore, rispettivamente (Tabella 3). Tuttavia, non è stato riscontrato alcun potenziale larvicida significativo di metileugenolo e carvone anche alle dosi più elevate, pertanto i valori di LC50 non sono stati calcolati (Tabella 3). Il larvicida sintetico Temephos ha mostrato una concentrazione letale media di 0,43 ppm contro Aedes aegypti in 24 ore di esposizione (Tabella 3, Tabella supplementare 6).
Sette composti (disolfuro di diallile, trisolfuro di diallile, eucaliptolo, α-pinene, eudesmolo, limonene e carvone) sono stati identificati come i principali composti di EO efficaci e sono stati testati individualmente contro zanzare adulte del genere Aedes egiziane. Secondo l'analisi di regressione Probit, l'eudesmolo è risultato avere il potenziale più elevato con un valore di LC50 di 1,82 ppm, seguito dall'eucaliptolo con un valore di LC50 di 17,60 ppm a 24 ore di esposizione. I restanti cinque composti testati si sono dimostrati moderatamente nocivi per gli adulti, con LC50 comprese tra 140,79 e 737,01 ppm (Tabella 3). Il malathion organofosforico sintetico si è rivelato meno potente dell'eudesmolo e più elevato rispetto agli altri sei composti, con un valore di LC50 di 5,44 ppm nel periodo di esposizione di 24 ore (Tabella 3, Tabella supplementare 6).
Sette potenti composti guida e il tamefosato organofosforico sono stati selezionati per formulare combinazioni binarie delle loro dosi di LC50 in un rapporto 1:1. Un totale di 28 combinazioni binarie sono state preparate e testate per la loro efficacia larvicida contro Aedes aegypti. Nove combinazioni sono risultate sinergiche, 14 combinazioni antagoniste e cinque combinazioni non larvicide. Tra le combinazioni sinergiche, la combinazione di disolfuro di diallile e temofol è risultata la più efficace, con una mortalità del 100% osservata dopo 24 ore (Tabella 4). Analogamente, le miscele di limonene con disolfuro di diallile ed eugenolo con timetfos hanno mostrato un buon potenziale con una mortalità larvale osservata del 98,3% (Tabella 5). Anche le restanti 4 combinazioni, ovvero eudesmolo più eucaliptolo, eudesmolo più limonene, eucaliptolo più alfa-pinene, alfa-pinene più temephos, hanno mostrato una significativa efficacia larvicida, con tassi di mortalità osservati superiori al 90%. Il tasso di mortalità atteso è prossimo al 60-75%. (Tabella 4). Tuttavia, la combinazione di limonene con α-pinene o eucalipto ha mostrato reazioni antagoniste. Analogamente, è stato riscontrato che miscele di temephos con eugenolo o eucalipto o eudesmolo o diallil trisolfuro hanno effetti antagonisti. Analogamente, la combinazione di diallil disolfuro e diallil trisolfuro e la combinazione di uno di questi composti con eudesmolo o eugenolo sono antagoniste nella loro azione larvicida. È stato segnalato antagonismo anche con la combinazione di eudesmolo con eugenolo o α-pinene.
Di tutte le 28 miscele binarie testate per l'attività acida negli adulti, 7 combinazioni sono risultate sinergiche, 6 non hanno avuto effetto e 15 sono risultate antagoniste. Le miscele di eudesmolo con eucalipto e limonene con carvone si sono rivelate più efficaci di altre combinazioni sinergiche, con tassi di mortalità a 24 ore rispettivamente del 76% e del 100% (Tabella 5). È stato osservato che il malathion mostra un effetto sinergico con tutte le combinazioni di composti, ad eccezione del limonene e del diallil trisolfuro. D'altra parte, è stato riscontrato antagonismo tra il diallil disolfuro e il diallil trisolfuro e la combinazione di uno di essi con eucalipto, o eucaliptolo, o carvone, o limonene. Analogamente, le combinazioni di α-pinene con eudesmolo o limonene, eucaliptolo con carvone o limonene e limonene con eudesmolo o malathion hanno mostrato effetti larvicidi antagonisti. Per le restanti sei combinazioni, non si è osservata alcuna differenza significativa tra la mortalità attesa e quella osservata (Tabella 5).
Sulla base degli effetti sinergici e delle dosi subletali, è stata infine selezionata e ulteriormente testata la loro tossicità larvicida contro un gran numero di zanzare Aedes aegypti. I risultati hanno mostrato che la mortalità larvale osservata utilizzando le combinazioni binarie eugenolo-limonene, diallil disolfuro-limonene e diallil disolfuro-timephos era del 100%, mentre la mortalità larvale attesa era rispettivamente del 76,48%, 72,16% e 63,4% (Tabella 6). La combinazione di limonene ed eudesmolo è stata relativamente meno efficace, con una mortalità larvale osservata dell'88% nel periodo di esposizione di 24 ore (Tabella 6). In sintesi, le quattro combinazioni binarie selezionate hanno anche dimostrato effetti larvicidi sinergici contro Aedes aegypti quando applicate su larga scala (Tabella 6).
Sono state selezionate tre combinazioni sinergiche per il biotest adultocida per il controllo di grandi popolazioni di Aedes aegypti adulte. Per selezionare le combinazioni da testare su grandi colonie di insetti, ci siamo concentrati innanzitutto sulle due migliori combinazioni sinergiche di terpeni, ovvero carvone più limonene ed eucaliptolo più eudesmolo. In secondo luogo, la migliore combinazione sinergica è stata selezionata tra la combinazione di malathion organofosfato sintetico e terpenoidi. Riteniamo che la combinazione di malathion ed eudesmolo sia la migliore per i test su grandi colonie di insetti, grazie alla più alta mortalità osservata e ai valori di LC50 molto bassi degli ingredienti candidati. Il malathion mostra sinergismo in combinazione con α-pinene, disolfuro di diallile, eucalipto, carvone ed eudesmolo. Tuttavia, se consideriamo i valori di LC50, l'eudesmolo presenta il valore più basso (2,25 ppm). I valori di LC50 calcolati di malathion, α-pinene, disolfuro di diallile, eucaliptolo e carvone erano rispettivamente 5,4, 716,55, 166,02, 17,6 e 140,79 ppm. Questi valori indicano che la combinazione di malathion ed eudesmolo è la combinazione ottimale in termini di dosaggio. I risultati hanno mostrato che le combinazioni di carvone più limonene ed eudesmolo più malathion hanno avuto una mortalità osservata del 100%, rispetto a una mortalità attesa dal 61% al 65%. Un'altra combinazione, eudesmolo più eucaliptolo, ha mostrato un tasso di mortalità del 78,66% dopo 24 ore di esposizione, rispetto a un tasso di mortalità atteso del 60%. Tutte e tre le combinazioni selezionate hanno dimostrato effetti sinergici anche quando applicate su larga scala contro Aedes aegypti adulta (Tabella 6).
In questo studio, oli essenziali vegetali selezionati come Mp, As, Os, Em e Cl hanno mostrato promettenti effetti letali sugli stadi larvali e adulti di Aedes aegypti. L'olio essenziale di Mp ha mostrato la più elevata attività larvicida con un valore di LC50 di 0,42 ppm, seguito dagli oli essenziali di As, Os ed Em con un valore di LC50 inferiore a 50 ppm dopo 24 ore. Questi risultati sono coerenti con studi precedenti su zanzare e altri ditteri10,11,12,13,14. Sebbene la potenza larvicida del Cl sia inferiore a quella di altri oli essenziali, con un valore di LC50 di 163,65 ppm dopo 24 ore, il suo potenziale negli adulti è il più elevato con un valore di LC50 di 23,37 ppm dopo 24 ore. Anche gli oli essenziali Mp, As ed Em hanno mostrato un buon potenziale allercida con valori di LC50 compresi tra 100 e 120 ppm a 24 ore di esposizione, ma erano relativamente inferiori alla loro efficacia larvicida. D'altra parte, gli oli essenziali Os hanno dimostrato un effetto allercida trascurabile anche alla dose terapeutica più elevata. Pertanto, i risultati indicano che la tossicità dell'ossido di etilene per le piante può variare a seconda dello stadio di sviluppo delle zanzare15. Dipende anche dalla velocità di penetrazione degli oli essenziali nell'organismo dell'insetto, dalla loro interazione con specifici enzimi bersaglio e dalla capacità di detossificazione della zanzara in ogni stadio di sviluppo16. Numerosi studi hanno dimostrato che il composto principale è un fattore importante nell'attività biologica dell'ossido di etilene, poiché rappresenta la maggior parte dei composti totali3,12,17,18. Pertanto, abbiamo considerato due composti principali in ciascun olio essenziale. Sulla base dei risultati della GC-MS, il disolfuro di diallile e il trisolfuro di diallile sono stati identificati come i principali composti dell'olio essenziale di As, il che è coerente con i risultati di studi precedenti19,20,21. Sebbene studi precedenti indicassero il mentolo come uno dei suoi composti principali, carvone e limonene sono stati nuovamente identificati come i principali composti dell'olio essenziale di Mp22,23. Il profilo compositivo dell'olio essenziale di Os ha mostrato che eugenolo e metil eugenolo sono i composti principali, il che è simile ai risultati di precedenti ricercatori16,24. L'eucaliptolo e l'eucaliptolo sono stati segnalati come i principali composti presenti nell'olio di foglie di Em, il che è coerente con i risultati di alcuni ricercatori25,26 ma contrario ai risultati di Olalade et al.27. La dominanza di cineolo e α-pinene è stata osservata nell'olio essenziale di melaleuca, il che è simile a studi precedenti28,29. Sono state segnalate e osservate anche in questo studio differenze intraspecifiche nella composizione e nella concentrazione di oli essenziali estratti dalla stessa specie vegetale in diverse località, che sono influenzate dalle condizioni geografiche di crescita della pianta, dal periodo di raccolta, dallo stadio di sviluppo o dall'età della pianta, dalla comparsa di chemiotipi, ecc.22,30,31,32. I composti chiave identificati sono stati quindi acquistati e testati per i loro effetti larvicidi e per gli effetti sulle zanzare adulte Aedes aegypti. I risultati hanno mostrato che l'attività larvicida del disolfuro di diallile era paragonabile a quella dell'olio essenziale di ascorbato grezzo. Tuttavia, l'attività del trisolfuro di diallile è superiore a quella dell'olio essenziale di ascorbato. Questi risultati sono simili a quelli ottenuti da Kimbaris et al. 33 su Culex philippines. Tuttavia, questi due composti non hanno mostrato una buona attività autocida contro le zanzare bersaglio, il che è coerente con i risultati di Plata-Rueda et al. 34 su Tenebrio molitor. L'ossido di etilene (Os EO) è efficace contro lo stadio larvale di Aedes aegypti, ma non contro lo stadio adulto. È stato stabilito che l'attività larvicida dei singoli composti principali è inferiore a quella dell'ossido di etilene grezzo. Ciò implica un ruolo per altri composti e le loro interazioni nell'ossido di etilene grezzo. Il metil eugenolo da solo ha un'attività trascurabile, mentre l'eugenolo da solo ha un'attività larvicida moderata. Questa conclusione conferma, da un lato,35,36, e dall'altro contraddice le conclusioni di ricercatori precedenti37,38. Le differenze nei gruppi funzionali di eugenolo e metileugenolo possono comportare diverse tossicità per lo stesso insetto bersaglio39. Il limonene è risultato avere un'attività larvicida moderata, mentre l'effetto del carvone è risultato insignificante. Analogamente, la tossicità relativamente bassa del limonene per gli insetti adulti e l'elevata tossicità del carvone supportano i risultati di alcuni studi precedenti40 ma ne contraddicono altri41. La presenza di doppi legami sia in posizione intraciclica che esociclica può aumentare i benefici di questi composti come larvicidi3,41, mentre il carvone, che è un chetone con atomi di carbonio alfa e beta insaturi, può mostrare un maggiore potenziale di tossicità negli adulti42. Tuttavia, le caratteristiche individuali di limonene e carvone sono molto inferiori al Mp totale dell'EO (Tabella 1, Tabella 3). Tra i terpenoidi testati, l'eudesmolo è risultato avere la maggiore attività larvicida e sugli adulti con un valore di LC50 inferiore a 2,5 ppm, rendendolo un composto promettente per il controllo delle zanzare Aedes. Le sue prestazioni sono migliori di quelle dell'intero EO Em, sebbene ciò non sia coerente con i risultati di Cheng et al.40. L'eudesmolo è un sesquiterpene con due unità isopreniche che è meno volatile dei monoterpeni ossigenati come l'eucalipto e quindi ha un maggiore potenziale come pesticida. L'eucaliptolo stesso ha una maggiore attività adulta rispetto a quella larvicida, e i risultati di studi precedenti supportano e confutano questa affermazione37,43,44. L'attività da sola è quasi paragonabile a quella dell'intero EO Cl. Un altro monoterpene biciclico, l'α-pinene, ha un effetto adulto su Aedes aegypti inferiore a quello larvicida, il che è l'opposto dell'effetto dell'EO Cl completo. L'attività insetticida complessiva dei terpenoidi è influenzata dalla loro lipofilia, volatilità, ramificazione del carbonio, area di proiezione, area superficiale, gruppi funzionali e loro posizioni45,46. Questi composti possono agire distruggendo gli accumuli cellulari, bloccando l'attività respiratoria, interrompendo la trasmissione degli impulsi nervosi, ecc.47 L'organofosfato sintetico Temephos ha dimostrato di avere la più elevata attività larvicida con un valore di LC50 di 0,43 ppm, coerente con i dati di Lek -Utala48. L'attività adulta del malathion organofosforico sintetico è stata segnalata a 5,44 ppm. Sebbene questi due organofosforici abbiano mostrato risposte favorevoli contro ceppi di laboratorio di Aedes aegypti, è stata segnalata resistenza delle zanzare a questi composti in diverse parti del mondo49. Tuttavia, non sono stati riscontrati casi simili di sviluppo di resistenza alle erbe medicinali50. Pertanto, i prodotti botanici sono considerati potenziali alternative ai pesticidi chimici nei programmi di controllo dei vettori.
L'effetto larvicida è stato testato su 28 combinazioni binarie (1:1) preparate da terpenoidi potenti e terpenoidi con timetfos, e 9 combinazioni sono risultate sinergiche, 14 antagoniste e 5 antagoniste. Nessun effetto. D'altra parte, nel biotest di potenza su adulti, 7 combinazioni sono risultate sinergiche, 15 combinazioni antagoniste e 6 combinazioni non hanno avuto alcun effetto. Il motivo per cui alcune combinazioni producono un effetto sinergico può essere dovuto all'interazione simultanea dei composti candidati in diverse vie importanti o all'inibizione sequenziale di diversi enzimi chiave di una particolare via biologica51. La combinazione di limonene con disolfuro di diallile, eucalipto o eugenolo si è rivelata sinergica sia in applicazioni su piccola che su larga scala (Tabella 6), mentre la sua combinazione con eucalipto o α-pinene ha mostrato effetti antagonisti sulle larve. In media, il limonene sembra essere un buon sinergizzante, probabilmente grazie alla presenza di gruppi metilici, alla buona penetrazione nello strato corneo e a un diverso meccanismo d'azione52,53. È stato precedentemente riportato che il limonene può causare effetti tossici penetrando nelle cuticole degli insetti (tossicità da contatto), influenzando l'apparato digerente (antifeedant) o influenzando l'apparato respiratorio (attività di fumigazione),54 mentre i fenilpropanoidi come l'eugenolo possono influenzare gli enzimi metabolici55. Pertanto, le combinazioni di composti con diversi meccanismi d'azione possono aumentare l'effetto letale complessivo della miscela. L'eucaliptolo è risultato sinergico con il disolfuro di diallile, l'eucalipto o l'α-pinene, ma altre combinazioni con altri composti si sono rivelate non larvicide o antagoniste. Studi precedenti hanno dimostrato che l'eucaliptolo ha attività inibitoria sull'acetilcolinesterasi (AChE), così come sui recettori dell'ottaammina e del GABA56. Poiché i monoterpeni ciclici, come eucaliptolo, eugenolo, ecc., possono avere lo stesso meccanismo d'azione della loro attività neurotossica,57 minimizzandone così gli effetti combinati attraverso l'inibizione reciproca, si è scoperto che la combinazione di temephos con diallil disolfuro, α-pinene e limonene è sinergica, a conferma di precedenti studi su un effetto sinergico tra prodotti erboristici e organofosfati sintetici58.
È stato riscontrato che la combinazione di eudesmolo ed eucaliptolo ha un effetto sinergico sugli stadi larvali e adulti di Aedes aegypti, probabilmente a causa delle loro diverse modalità d'azione dovute alle loro diverse strutture chimiche. L'eudesmolo (un sesquiterpene) può influire sul sistema respiratorio 59 e l'eucaliptolo (un monoterpene) può influire sull'acetilcolinesterasi 60 . La co-esposizione degli ingredienti a due o più siti bersaglio può aumentare l'effetto letale complessivo della combinazione. Nei biotest di sostanze adulte, il malathion è risultato sinergico con carvone o eucaliptolo o disolfuro di diallile o α-pinene, indicando che è sinergico con l'aggiunta di limonene e di. Buoni candidati allercidi sinergici per l'intero portafoglio di composti terpenici, ad eccezione dell'allil trisolfuro. Anche Thangam e Kathiresan61 hanno riportato risultati simili sull'effetto sinergico del malathion con estratti vegetali. Questa risposta sinergica potrebbe essere dovuta agli effetti tossici combinati del malathion e dei fitochimici sugli enzimi detossificanti degli insetti. Gli organofosfati come il malathion agiscono generalmente inibendo le esterasi e le monoossigenasi del citocromo P45062,63,64. Pertanto, la combinazione di malathion con questi meccanismi d'azione e terpeni con meccanismi d'azione diversi può aumentare l'effetto letale complessivo sulle zanzare.
D'altra parte, l'antagonismo indica che i composti selezionati sono meno attivi in combinazione rispetto a ciascun composto singolarmente. La ragione dell'antagonismo in alcune combinazioni potrebbe essere che un composto modifica il comportamento dell'altro composto cambiandone la velocità di assorbimento, distribuzione, metabolismo o escrezione. I primi ricercatori consideravano questa la causa dell'antagonismo nelle combinazioni di farmaci. Molecole Possibile meccanismo 65. Analogamente, possibili cause di antagonismo possono essere correlate a meccanismi d'azione simili, ovvero alla competizione dei composti costituenti per lo stesso recettore o sito bersaglio. In alcuni casi, può verificarsi anche un'inibizione non competitiva della proteina bersaglio. In questo studio, due composti organosolforici, il diallil disolfuro e il diallil trisolfuro, hanno mostrato effetti antagonisti, probabilmente dovuti alla competizione per lo stesso sito bersaglio. Analogamente, questi due composti solforati hanno mostrato effetti antagonisti e non hanno avuto alcun effetto quando combinati con eudesmolo e α-pinene. Eudesmolo e alfa-pinene sono di natura ciclica, mentre disolfuro di diallile e trisolfuro di diallile sono di natura alifatica. In base alla struttura chimica, la combinazione di questi composti dovrebbe aumentare l'attività letale complessiva poiché i loro siti bersaglio sono solitamente diversi34,47, ma sperimentalmente abbiamo riscontrato antagonismo, che potrebbe essere dovuto al ruolo di questi composti in alcuni organismi sconosciuti in vivo, sistemi a seguito di interazione. Analogamente, la combinazione di cineolo e α-pinene ha prodotto risposte antagoniste, sebbene i ricercatori abbiano precedentemente riportato che i due composti hanno bersagli d'azione diversi47,60. Poiché entrambi i composti sono monoterpeni ciclici, potrebbero esserci alcuni siti bersaglio comuni che potrebbero competere per il legame e influenzare la tossicità complessiva delle coppie combinatorie studiate.
Sulla base dei valori di LC50 e della mortalità osservata, sono state selezionate le due migliori combinazioni sinergiche di terpeni, ovvero le coppie carvone + limonene ed eucaliptolo + eudesmolo, nonché il malathion organofosforico sintetico con terpeni. La combinazione sinergica ottimale di malathion + eudesmolo è stata testata in un biotest insetticida su adulti. È necessario testare grandi colonie di insetti per confermare se queste combinazioni efficaci possano essere efficaci contro un gran numero di individui in spazi di esposizione relativamente ampi. Tutte queste combinazioni dimostrano un effetto sinergico contro grandi sciami di insetti. Risultati simili sono stati ottenuti per una combinazione larvicida sinergica ottimale testata contro grandi popolazioni di larve di Aedes aegypti. Pertanto, si può affermare che l'efficace combinazione sinergica larvicida e adulticida di composti EO vegetali è un valido candidato contro le sostanze chimiche di sintesi esistenti e può essere ulteriormente utilizzata per controllare le popolazioni di Aedes aegypti. Allo stesso modo, efficaci combinazioni di larvicidi o adulticidi sintetici con terpeni possono essere utilizzate anche per ridurre le dosi di timetfos o malathion somministrate alle zanzare. Queste potenti combinazioni sinergiche potrebbero fornire soluzioni per futuri studi sull'evoluzione della resistenza ai farmaci nelle zanzare Aedes.
Le uova di Aedes aegypti sono state raccolte presso il Centro Regionale di Ricerca Medica di Dibrugarh, Consiglio Indiano per la Ricerca Medica, e conservate a temperatura controllata (28 ± 1 °C) e umidità (85 ± 5%) presso il Dipartimento di Zoologia dell'Università di Gauhati, nelle seguenti condizioni: Arivoli sono stati descritti et al. Dopo la schiusa, le larve sono state alimentate con cibo per larve (polvere di biscotti per cani e lievito in rapporto 3:1) e gli adulti con una soluzione di glucosio al 10%. A partire dal terzo giorno dopo la schiusa, le zanzare femmine adulte sono state lasciate succhiare il sangue di ratti albini. Immergere la carta da filtro in acqua in un bicchiere e posizionarlo nella gabbia di deposizione delle uova.
Campioni vegetali selezionati: foglie di eucalipto (Myrtaceae), basilico sacro (Lamiaceae), menta (Lamiaceae), melaleuca (Myrtaceae) e bulbi di aglio (Amaryllidaceae). Raccolti a Guwahati e identificati dal Dipartimento di Botanica dell'Università di Gauhati. I campioni vegetali raccolti (500 g) sono stati sottoposti a idrodistillazione utilizzando un apparecchio Clevenger per 6 ore. L'olio essenziale estratto è stato raccolto in fiale di vetro pulite e conservato a 4 °C per ulteriori studi.
La tossicità larvicida è stata studiata utilizzando procedure standard leggermente modificate dell'Organizzazione Mondiale della Sanità 67 . Utilizzare DMSO come emulsionante. Ogni concentrazione di EO è stata inizialmente testata a 100 e 1000 ppm, esponendo 20 larve in ogni replica. In base ai risultati, è stato applicato un intervallo di concentrazione e la mortalità è stata registrata da 1 ora a 6 ore (a intervalli di 1 ora) e a 24 ore, 48 ore e 72 ore dopo il trattamento. Le concentrazioni subletali (LC50) sono state determinate dopo 24, 48 e 72 ore di esposizione. Ogni concentrazione è stata saggiata in triplicato insieme a un controllo negativo (solo acqua) e un controllo positivo (acqua trattata con DMSO). Se si verifica l'impupamento e più del 10% delle larve del gruppo di controllo muore, l'esperimento viene ripetuto. Se il tasso di mortalità nel gruppo di controllo è compreso tra il 5 e il 10%, utilizzare la formula di correzione di Abbott 68.
Il metodo descritto da Ramar et al. 69 è stato utilizzato per un biotest su adulti di Aedes aegypti utilizzando acetone come solvente. Ogni olio essenziale è stato inizialmente testato contro zanzare adulte di Aedes aegypti a concentrazioni di 100 e 1000 ppm. Applicare 2 ml di ciascuna soluzione preparata al numero Whatman. 1 foglio di carta da filtro (dimensioni 12 x 15 cm²) e lasciare evaporare l'acetone per 10 minuti. Carta da filtro trattata con soli 2 ml di acetone è stata utilizzata come controllo. Dopo l'evaporazione dell'acetone, la carta da filtro trattata e la carta da filtro di controllo sono state poste in una provetta cilindrica (profonda 10 cm). Dieci zanzare di 3-4 giorni di età, non ematofaghe, sono state trasferite in triplicati di ciascuna concentrazione. Sulla base dei risultati dei test preliminari, sono state testate diverse concentrazioni di oli selezionati. La mortalità è stata registrata a 1 ora, 2 ore, 3 ore, 4 ore, 5 ore, 6 ore, 24 ore, 48 ore e 72 ore dopo il rilascio delle zanzare. Calcolare i valori di LC50 per tempi di esposizione di 24 ore, 48 ore e 72 ore. Se il tasso di mortalità del lotto di controllo supera il 20%, ripetere l'intero test. Analogamente, se il tasso di mortalità nel gruppo di controllo è superiore al 5%, correggere i risultati per i campioni trattati utilizzando la formula di Abbott68.
Per analizzare i composti costituenti degli oli essenziali selezionati sono state eseguite gascromatografia (Agilent 7890A) e spettrometria di massa (Accu TOF GCv, Jeol). Il gascromatografo era dotato di un rivelatore FID e di una colonna capillare (HP5-MS). Il gas di trasporto era l'elio, con una portata di 1 ml/min. Il programma GC imposta Allium sativum a 10:80-1M-8-220-5M-8-270-9M e Ocimum Sainttum a 10:80-3M-8-200-3M-10-275-1M-5 – 280, per la menta 10:80-1M-8-200-5M-8-275-1M-5-280, per l'eucalipto 20:60-1M-10-200-3M-30-280 e per il rosso Per mille strati sono 10:60-1M-8-220-5M-8-270-3M.
I principali composti di ciascun EO sono stati identificati in base alla percentuale di area calcolata dal cromatogramma GC e dai risultati della spettrometria di massa (con riferimento al database degli standard NIST 70).
I due composti principali in ciascun EO sono stati selezionati in base ai risultati della GC-MS e acquistati da Sigma-Aldrich a una purezza del 98-99% per ulteriori biotest. I composti sono stati testati per l'efficacia larvicida e per gli adulti contro Aedes aegypti come descritto sopra. I larvicidi sintetici più comunemente utilizzati, il tamefosato (Sigma Aldrich) e il farmaco per adulti malathion (Sigma Aldrich), sono stati analizzati per confrontarne l'efficacia con composti EO selezionati, seguendo la stessa procedura.
Miscele binarie di composti terpenici selezionati e composti terpenici più organofosfati commerciali (tilephos e malathion) sono state preparate miscelando la dose di LC50 di ciascun composto candidato in un rapporto 1:1. Le combinazioni preparate sono state testate su stadi larvali e adulti di Aedes aegypti come descritto sopra. Ogni biotest è stato eseguito in triplicato per ciascuna combinazione e in triplicato per i singoli composti presenti in ciascuna combinazione. La morte degli insetti target è stata registrata dopo 24 ore. Calcolare il tasso di mortalità atteso per una miscela binaria utilizzando la seguente formula.
dove E = tasso di mortalità previsto delle zanzare Aedes aegypti in risposta a una combinazione binaria, ovvero la connessione (A + B).
L'effetto di ciascuna miscela binaria è stato etichettato come sinergico, antagonista o nullo in base al valore di χ⁻ calcolato con il metodo descritto da Pavla52. Calcolare il valore di χ⁻ per ciascuna combinazione utilizzando la seguente formula.
L'effetto di una combinazione è stato definito sinergico quando il valore di χ⁻ calcolato era maggiore del valore di tabella per i corrispondenti gradi di libertà (intervallo di confidenza al 95%) e se la mortalità osservata superava quella attesa. Analogamente, se il valore di χ⁻ calcolato per qualsiasi combinazione supera il valore di tabella con alcuni gradi di libertà, ma la mortalità osservata è inferiore a quella attesa, il trattamento è considerato antagonista. Se, invece, in qualsiasi combinazione il valore di χ⁻ calcolato è inferiore al valore di tabella nei corrispondenti gradi di libertà, la combinazione è considerata inefficace.
Sono state selezionate da tre a quattro combinazioni potenzialmente sinergiche (100 larve e 50 insetti larvicidi e adulti) per testarle contro un ampio numero di insetti. Gli adulti) procedono come sopra. Oltre alle miscele, i singoli composti presenti nelle miscele selezionate sono stati testati anche su un numero uguale di larve e adulti di Aedes aegypti. Il rapporto di combinazione è pari a una parte di dose LC50 di un composto candidato e una parte di dose LC50 dell'altro composto costituente. Nel biotest di attività degli adulti, i composti selezionati sono stati sciolti nel solvente acetone e applicati su carta da filtro avvolta in un contenitore cilindrico di plastica da 1300 cm³. L'acetone è stato evaporato per 10 minuti e gli adulti sono stati rilasciati. Analogamente, nel biotest larvicida, le dosi dei composti candidati LC50 sono state prima sciolte in volumi uguali di DMSO e poi miscelate con 1 litro di acqua conservata in contenitori di plastica da 1300 cc, quindi le larve sono state rilasciate.
È stata eseguita un'analisi probabilistica di 71 dati di mortalità registrati utilizzando il software SPSS (versione 16) e Minitab per calcolare i valori LC50.
Data di pubblicazione: 01-07-2024