Il nematode del pino è un endoparassita migratore da quarantena, noto per causare gravi perdite economiche negli ecosistemi delle pinete. Il presente studio esamina l'attività nematocida degli indoli alogenati contro i nematodi del pino e il loro meccanismo d'azione. Le attività nematocide di 5-iodoindolo e avermectina (controllo positivo) contro i nematodi del pino erano simili ed elevate a basse concentrazioni (10 μg/mL). Il 5-iodoindolo ha ridotto la fecondità, l'attività riproduttiva, la mortalità embrionale e larvale e il comportamento locomotorio. Le interazioni molecolari dei ligandi con i recettori dei canali del cloro glutammato-dipendenti specifici degli invertebrati supportano l'ipotesi che il 5-iodoindolo, come l'avermectina, si leghi saldamente al sito attivo del recettore. Il 5-iodoindolo ha anche indotto varie deformazioni fenotipiche nei nematodi, tra cui collasso/restringimento anomalo degli organi e aumento della vacuolizzazione. Questi risultati suggeriscono che i vacuoli possano svolgere un ruolo nella morte dei nematodi mediata dalla metilazione. È importante sottolineare che il 5-iodoindolo non si è dimostrato tossico per entrambe le specie vegetali (cavolo e ravanello). Pertanto, questo studio dimostra che l'applicazione di iodoindolo in condizioni ambientali favorevoli può controllare i danni da disseccamento del pino.
Il nematode del pino (Bursaphelenchus xylophilus) appartiene ai nematodi del pino (PWN), nematodi endoparassiti migratori noti per causare gravi danni ecologici agli ecosistemi delle pinete1. La malattia del pino avvizzito (PWD) causata dal nematode del pino sta diventando un problema serio in diversi continenti, tra cui Asia ed Europa, e in Nord America il nematode distrugge specie di pino introdotte1,2. Il declino dei pini è un grave problema economico e la prospettiva della sua diffusione globale è preoccupante3. Le seguenti specie di pino sono più comunemente attaccate dal nematode: Pinus densiflora, Pinus sylvestris, Pinus thunbergii, Pinus koraiensis, Pinus thunbergii, Pinus thunbergii e Pinus radiata4. Il nematode del pino è una grave malattia che può uccidere i pini entro poche settimane o mesi dall'infezione. Inoltre, le epidemie di nematode del pino sono comuni in una varietà di ecosistemi, quindi sono state stabilite catene di infezione persistenti1.
Bursaphelenchus xylophilus è un nematode fitoparassita da quarantena appartenente alla superfamiglia Aphelenchoidea e al clade 102.5. Il nematode si nutre di funghi e si riproduce nei tessuti legnosi dei pini, sviluppandosi in quattro diversi stadi larvali: L1, L2, L3, L4 e un individuo adulto1,6. In condizioni di carenza di cibo, il nematode del pino passa a uno stadio larvale specializzato – dauer – che parassita il suo vettore, il scolitide del pino (Monochamus alternatus), e viene trasferito ai pini sani. Negli ospiti sani, i nematodi migrano rapidamente attraverso i tessuti vegetali e si nutrono di cellule parenchimatose, il che porta a diverse reazioni di ipersensibilità, avvizzimento del pino e morte entro un anno dall'infezione1,7,8.
Il controllo biologico dei nematodi del pino è da tempo una sfida, con misure di quarantena che risalgono al XX secolo. Le attuali strategie per il controllo dei nematodi del pino prevedono principalmente trattamenti chimici, tra cui la fumigazione del legno e l'impianto di nematocidi nei tronchi degli alberi. I nematocidi più comunemente utilizzati sono l'avermectina e il benzoato di avermectina, appartenenti alla famiglia delle avermectine. Queste sostanze chimiche costose sono altamente efficaci contro molte specie di nematodi e sono considerate sicure per l'ambiente9. Tuttavia, si prevede che l'uso ripetuto di questi nematocidi creerà una pressione selettiva che porterà quasi certamente all'emergere di nematodi del pino resistenti, come è stato dimostrato per diversi insetti nocivi, come Leptinotarsa decemlineata, Plutella xylostella e i nematodi Trichostrongylus colubriformis e Ostertagia circumcincta, che hanno gradualmente sviluppato resistenza alle avermectine10,11,12. Pertanto, è necessario studiare regolarmente i modelli di resistenza e sottoporre a screening continuo i nematocidi per trovare misure alternative, economiche ed ecocompatibili per il controllo della PVD. Negli ultimi decenni, diversi autori hanno proposto l'uso di estratti vegetali, oli essenziali e composti volatili come agenti di controllo dei nematodi13,14,15,16.
Abbiamo recentemente dimostrato l'attività nematocida dell'indolo, una molecola di segnalazione intercellulare e interregno, in Caenorhabditis elegans 17 . L'indolo è un segnale intracellulare diffuso nell'ecologia microbica, che controlla numerose funzioni che influenzano la fisiologia microbica, la formazione di spore, la stabilità dei plasmidi, la resistenza ai farmaci, la formazione di biofilm e la virulenza 18, 19 . L'attività dell'indolo e dei suoi derivati contro altri nematodi patogeni non è stata studiata. In questo studio, abbiamo indagato l'attività nematocida di 34 indoli contro i nematodi del pino e chiarito il meccanismo d'azione del più potente 5-iodoindolo utilizzando microscopia, fotografia time-lapse ed esperimenti di docking molecolare, e valutato i suoi effetti tossici sulle piante utilizzando un test di germinazione dei semi.
È stato precedentemente riportato che concentrazioni elevate (>1,0 mM) di indolo hanno un effetto nematocida sui nematodi17. In seguito al trattamento di B. xylophilus (stadi vitali misti) con indolo o 33 diversi derivati dell'indolo a 1 mM, la mortalità di B. xylophilus è stata misurata contando i nematodi vivi e morti nei gruppi di controllo e trattati. Cinque indoli hanno mostrato una significativa attività nematocida; la sopravvivenza del gruppo di controllo non trattato è stata del 95 ± 7% dopo 24 ore. Dei 34 indoli testati, 5-iodoindolo e 4-fluoroindolo a 1 mM hanno causato il 100% di mortalità, mentre 5,6-difluoroindaco, metilindolo-7-carbossilato e 7-iodoindolo hanno causato circa il 50% di mortalità (Tabella 1).
Effetto del 5-iodoindolo sulla formazione di vacuoli e sul metabolismo del nematode del pino. (A) Effetto dell'avermectina e del 5-iodoindolo sui nematodi maschi adulti, (B) uova di nematode allo stadio L1 e (C) metabolismo di B. xylophilus, (i) non sono stati osservati vacuoli a 0 ore, il trattamento ha determinato (ii) vacuoli, (iii) accumulo di vacuoli multipli, (iv) rigonfiamento dei vacuoli, (v) fusione dei vacuoli e (vi) formazione di vacuoli giganti. Le frecce rosse indicano il rigonfiamento dei vacuoli, le frecce blu indicano la fusione dei vacuoli e le frecce nere indicano i vacuoli giganti. Barra della scala = 50 μm.
Inoltre, questo studio ha anche descritto il processo sequenziale di morte indotta da metano nei nematodi del pino (Figura 4C). La morte metanogenica è un tipo di morte cellulare non apoptotica associata all'accumulo di prominenti vacuoli citoplasmatici27. I difetti morfologici osservati nei nematodi del pino sembrano essere strettamente correlati al meccanismo di morte indotta da metano. L'esame microscopico a tempi diversi ha mostrato che si formavano vacuoli giganti dopo 20 ore di esposizione a 5-iodoindolo (0,1 mM). Vacuoli microscopici sono stati osservati dopo 8 ore di trattamento e il loro numero è aumentato dopo 12 ore. Diversi vacuoli di grandi dimensioni sono stati osservati dopo 14 ore. Diversi vacuoli fusi erano chiaramente visibili dopo 12-16 ore di trattamento, indicando che la fusione dei vacuoli è la base del meccanismo di morte metanogenica. Dopo 20 ore, diversi vacuoli giganti sono stati trovati in tutto il verme. Queste osservazioni rappresentano la prima segnalazione di metuosi in C. elegans.
Nei vermi trattati con 5-iodoindolo, è stata osservata anche l'aggregazione e la rottura dei vacuoli (Fig. 5), come evidenziato dalla piegatura del verme e dal rilascio dei vacuoli nell'ambiente. La rottura dei vacuoli è stata osservata anche nella membrana del guscio d'uovo, che viene normalmente preservata intatta da L2 durante la schiusa (Fig. S2 supplementare). Queste osservazioni supportano il coinvolgimento dell'accumulo di liquidi e del fallimento osmoregolatorio, nonché del danno cellulare reversibile (RCI), nel processo di formazione e suppurazione dei vacuoli (Fig. 5).
Ipotizzando il ruolo dello iodio nella formazione di vacuoli osservata, abbiamo studiato l'attività nematocida dello ioduro di sodio (NaI) e dello ioduro di potassio (KI). Tuttavia, a concentrazioni (0,1, 0,5 o 1 mM), non hanno influenzato né la sopravvivenza dei nematodi né la formazione di vacuoli (Figura supplementare S5), sebbene 1 mM di KI abbia avuto un lieve effetto nematocida. D'altra parte, il 7-iodoindolo (1 o 2 mM), come il 5-iodoindolo, ha indotto vacuoli multipli e deformazioni strutturali (Figura supplementare S6). I due iodoindoli hanno mostrato caratteristiche fenotipiche simili nei nematodi del pino, mentre NaI e KI no. È interessante notare che l'indolo non ha indotto la formazione di vacuoli in B. xylophilus alle concentrazioni testate (dati non mostrati). Pertanto, i risultati hanno confermato che il complesso indolo-iodio è responsabile della vacuolizzazione e del metabolismo di B. xylophilus.
Tra gli indoli testati per l'attività nematocida, il 5-iodoindolo ha avuto l'indice di scivolamento più elevato, pari a -5,89 kcal/mol, seguito dal 7-iodoindolo (-4,48 kcal/mol), dal 4-fluoroindolo (-4,33) e dall'indolo (-4,03) (Figura 6). Il forte legame a idrogeno principale del 5-iodoindolo alla leucina 218 ne stabilizza il legame, mentre tutti gli altri derivati indolici si legano alla serina 260 tramite legami a idrogeno a catena laterale. Tra gli altri iodoindoli modellati, il 2-iodoindolo ha un valore di legame di -5,248 kcal/mol, dovuto al suo principale legame a idrogeno con la leucina 218. Altri legami noti includono il 3-iodoindolo (-4,3 kcal/mol), il 4-iodoindolo (-4,0 kcal/mol) e il 6-fluoroindolo (-2,6 kcal/mol) (Figura supplementare S8). La maggior parte degli indoli alogenati e l'indolo stesso, ad eccezione di 5-iodoindolo e 2-iodoindolo, formano un legame con la serina 260. Il fatto che il legame a idrogeno con la leucina 218 sia indicativo di un legame recettore-ligando efficiente, come osservato per l'ivermectina (Figura supplementare S7), conferma che 5-iodoindolo e 2-iodoindolo, come l'ivermectina, si legano saldamente al sito attivo del recettore GluCL tramite la leucina 218 (Figura 6 e Figura supplementare S8). Proponiamo che questo legame sia necessario per mantenere la struttura a poro aperto del complesso GluCL e che, legandosi saldamente al sito attivo del recettore GluCL, 5-iodoindolo, 2-iodoindolo, avermectina e ivermectina mantengano aperto il canale ionico e consentano l'assorbimento dei fluidi.
Docking molecolare dell'indolo e dell'indolo alogenato a GluCL. Orientamenti di legame dei ligandi (A) indolo, (B) 4-fluoroindolo, (C) 7-iodoindolo e (D) 5-iodoindolo al sito attivo di GluCL. La proteina è rappresentata da un nastro e i legami idrogeno dello scheletro sono mostrati da linee tratteggiate gialle. (A'), (B'), (C') e (D') mostrano le interazioni dei corrispondenti ligandi con i residui amminoacidici circostanti, e i legami idrogeno della catena laterale sono indicati da frecce tratteggiate rosa.
Sono stati condotti esperimenti per valutare l'effetto tossico del 5-iodoindolo sulla germinazione di semi di cavolo e ravanello. Il 5-iodoindolo (0,05 o 0,1 mM) o l'avermectina (10 μg/mL) hanno avuto scarso o nessun effetto sulla germinazione iniziale e sull'emergenza delle piantine (Figura 7). Inoltre, non è stata riscontrata alcuna differenza significativa tra il tasso di germinazione dei controlli non trattati e dei semi trattati con 5-iodoindolo o avermectina. L'effetto sull'allungamento del fittone e sul numero di radici laterali formate è stato insignificante, sebbene 1 mM (10 volte la sua concentrazione attiva) di 5-iodoindolo abbia leggermente ritardato lo sviluppo delle radici laterali. Questi risultati indicano che il 5-iodoindolo non è tossico per le cellule vegetali e non interferisce con i processi di sviluppo delle piante alle concentrazioni studiate.
Effetto del 5-iodoindolo sulla germinazione dei semi. Germinazione, germogliamento e radicazione laterale di semi di B. oleracea e R. raphanistrum su terreno di coltura Murashige e Skoog agar con o senza avermectina o 5-iodoindolo. La germinazione è stata registrata dopo 3 giorni di incubazione a 22 °C.
Questo studio riporta diversi casi di uccisione di nematodi da parte di indoli. È importante sottolineare che questo è il primo caso di metilazione indotta da iodoindolo (un processo causato dall'accumulo di piccoli vacuoli che gradualmente si fondono in vacuoli giganti, portando infine alla rottura della membrana e alla morte) negli aghi di pino, con lo iodoindolo che mostra significative proprietà nematocide simili a quelle del nematocida commerciale avermectina.
È stato precedentemente riportato che gli indoli esercitano molteplici funzioni di segnalazione nei procarioti e negli eucarioti, tra cui l'inibizione/formazione di biofilm, la sopravvivenza batterica e la patogenicità19,32,33,34. Recentemente, i potenziali effetti terapeutici degli indoli alogenati, degli alcaloidi indolici e dei derivati indolici semisintetici hanno attirato un ampio interesse di ricerca35,36,37. Ad esempio, è stato dimostrato che gli indoli alogenati uccidono le cellule persistenti di Escherichia coli e Staphylococcus aureus37. Inoltre, è di interesse scientifico studiare l'efficacia degli indoli alogenati contro altre specie, generi e regni, e questo studio rappresenta un passo avanti verso il raggiungimento di questo obiettivo.
In questo studio, proponiamo un meccanismo per la letalità indotta da 5-iodoindolo in C. elegans basato sul danno cellulare reversibile (RCI) e sulla metilazione (Figure 4C e 5). Alterazioni edematose come gonfiore e degenerazione vacuolare sono indicatori di RCI e metilazione, che si manifestano come vacuoli giganti nel citoplasma48,49. Il RCI interferisce con la produzione di energia riducendo la produzione di ATP, causando il collasso della pompa ATPasi o interrompendo le membrane cellulari e causando un rapido afflusso di Na+, Ca2+ e acqua50,51,52. I vacuoli intracitoplasmatici si formano nelle cellule animali a causa dell'accumulo di liquidi nel citoplasma dovuto all'afflusso di Ca2+ e acqua53. È interessante notare che questo meccanismo di danno cellulare è reversibile se il danno è temporaneo e le cellule iniziano a produrre ATP per un certo periodo di tempo, ma se il danno persiste o peggiora, le cellule muoiono.54 Le nostre osservazioni mostrano che i nematodi trattati con 5-iodoindolo non sono in grado di ripristinare la normale biosintesi dopo l'esposizione a condizioni di stress.
Il fenotipo di metilazione indotto dal 5-iodoindolo in B. xylophilus potrebbe essere dovuto alla presenza di iodio e alla sua distribuzione molecolare, poiché il 7-iodoindolo ha avuto un effetto inibitorio minore su B. xylophilus rispetto al 5-iodoindolo (Tabella 1 e Figura supplementare S6). Questi risultati sono parzialmente coerenti con gli studi di Maltese et al. (2014), che hanno riportato che la traslocazione della frazione piridilica dell'azoto indolo dalla posizione para alla posizione meta ha abolito la vacuolizzazione, l'inibizione della crescita e la citotossicità nelle cellule U251, suggerendo che l'interazione della molecola con uno specifico sito attivo nella proteina sia critica27,44,45. Anche le interazioni tra indolo o indoli alogenati e recettori GluCL osservate in questo studio supportano questa ipotesi, poiché è stato riscontrato che il 5- e il 2-iodoindolo si legano ai recettori GluCL più fortemente rispetto agli altri indoli esaminati (Figura 6 e Figura supplementare S8). È stato riscontrato che lo iodio in seconda o quinta posizione dell'indolo si lega alla leucina 218 del recettore GluCL tramite legami a idrogeno lungo lo scheletro, mentre altri indoli alogenati e l'indolo stesso formano deboli legami a idrogeno a catena laterale con la serina 260 (Figura 6). Pertanto, ipotizziamo che la localizzazione dell'alogeno svolga un ruolo importante nell'induzione della degenerazione vacuolare, mentre il forte legame del 5-iodoindolo mantenga aperto il canale ionico, consentendo così un rapido afflusso di fluido e la rottura del vacuolo. Tuttavia, il meccanismo d'azione dettagliato del 5-iodoindolo deve ancora essere determinato.
Prima dell'applicazione pratica del 5-iodoindolo, è necessario analizzarne l'effetto tossico sulle piante. I nostri esperimenti sulla germinazione dei semi hanno dimostrato che il 5-iodoindolo non ha avuto effetti negativi sulla germinazione dei semi o sui successivi processi di sviluppo alle concentrazioni studiate (Figura 7). Pertanto, questo studio fornisce una base per l'uso del 5-iodoindolo nell'ambiente ecologico per controllare la nocività dei nematodi del pino sui pini.
Precedenti studi hanno dimostrato che la terapia a base di indolo rappresenta un potenziale approccio per affrontare il problema della resistenza agli antibiotici e della progressione del cancro55. Inoltre, gli indoli possiedono attività antibatterica, antitumorale, antiossidante, antinfiammatoria, antidiabetica, antivirale, antiproliferativa e antitubercolare e possono costituire una base promettente per lo sviluppo di farmaci56,57. Questo studio suggerisce per la prima volta il potenziale utilizzo dello iodio come agente antiparassitario e antielmintico.
L'avermectina è stata scoperta tre decenni fa e ha vinto il Premio Nobel nel 2015, e il suo utilizzo come antielmintico è ancora in corso. Tuttavia, a causa del rapido sviluppo di resistenza alle avermectine nei nematodi e negli insetti nocivi, è necessaria una strategia alternativa, economica ed ecologica per controllare l'infezione da nematodi del pino (PWN) nei pini. Questo studio illustra anche il meccanismo con cui il 5-iodoindolo uccide i nematodi del pino e la sua bassa tossicità per le cellule vegetali, il che apre buone prospettive per la sua futura applicazione commerciale.
Tutti gli esperimenti sono stati approvati dal Comitato etico dell'Università di Yeungnam, Gyeongsan, Corea, e i metodi sono stati eseguiti in conformità con le linee guida del Comitato etico dell'Università di Yeungnam.
Gli esperimenti di incubazione delle uova sono stati eseguiti utilizzando procedure consolidate43. Per valutare i tassi di schiusa (HR), nematodi adulti di 1 giorno di età (circa 100 femmine e 100 maschi) sono stati trasferiti in piastre Petri contenenti il fungo e lasciati crescere per 24 ore. Le uova sono state quindi isolate e trattate con 5-iodoindolo (0,05 mM e 0,1 mM) o avermectina (10 μg/ml) come sospensione in acqua distillata sterile. Queste sospensioni (500 μl; circa 100 uova) sono state trasferite nei pozzetti di una piastra per coltura tissutale a 24 pozzetti e incubate a 22 °C. Il conteggio L2 è stato effettuato dopo 24 ore di incubazione, ma le cellule sono state considerate morte se non si muovevano quando stimolate con un filo di platino sottile. Questo esperimento è stato condotto in due fasi, ciascuna con sei ripetizioni. I dati di entrambi gli esperimenti sono stati combinati e presentati. La percentuale di HR è calcolata come segue:
La mortalità larvale è stata valutata utilizzando procedure precedentemente sviluppate. Le uova di nematodi sono state raccolte e gli embrioni sono stati sincronizzati tramite schiusa in acqua distillata sterile per generare larve allo stadio L2. Le larve sincronizzate (circa 500 nematodi) sono state trattate con 5-iodoindolo (0,05 mM e 0,1 mM) o avermectina (10 μg/ml) e allevate su piastre Petri di B. cinerea. Dopo 48 ore di incubazione a 22 °C, i nematodi sono stati raccolti in acqua distillata sterile ed esaminati per la presenza degli stadi L2, L3 e L4. La presenza degli stadi L3 e L4 indicava la trasformazione larvale, mentre la presenza dello stadio L2 non indicava alcuna trasformazione. Le immagini sono state acquisite utilizzando il sistema di imaging cellulare digitale iRiS™. Questo esperimento è stato condotto in due fasi, ciascuna con sei ripetizioni. I dati di entrambi gli esperimenti sono stati combinati e presentati.
La tossicità di 5-iodoindolo e avermectina per i semi è stata valutata utilizzando test di germinazione su piastre di agar Murashige e Skoog.62 I semi di B. oleracea e R. raphanistrum sono stati prima immersi in acqua distillata sterile per un giorno, lavati con 1 ml di etanolo al 100%, sterilizzati con 1 ml di candeggina commerciale al 50% (ipoclorito di sodio al 3%) per 15 minuti e lavati cinque volte con 1 ml di acqua sterile. I semi sterilizzati sono stati quindi pressati su piastre di agar per germinazione contenenti 0,86 g/l (0,2X) di terreno Murashige e Skoog e 0,7% di agar batteriologico con o senza 5-iodoindolo o avermectina. Le piastre sono state quindi incubate a 22 °C e le immagini sono state acquisite dopo 3 giorni di incubazione. Questo esperimento è stato condotto in due fasi, ciascuna delle quali prevedeva sei ripetizioni.
Data di pubblicazione: 26 febbraio 2025