Il nematode del pino è un endoparassita migratorio soggetto a quarantena, noto per causare gravi perdite economiche negli ecosistemi delle pinete. Il presente studio esamina l'attività nematocida degli indoli alogenati contro il nematode del pino e il loro meccanismo d'azione. L'attività nematocida del 5-iodoindolo e dell'avermectina (controllo positivo) contro il nematode del pino è risultata simile ed elevata a basse concentrazioni (10 μg/mL). Il 5-iodoindolo ha ridotto la fecondità, l'attività riproduttiva, la mortalità embrionale e larvale e il comportamento motorio. Le interazioni molecolari dei ligandi con i recettori del canale del cloro attivati dal glutammato, specifici degli invertebrati, supportano l'ipotesi che il 5-iodoindolo, come l'avermectina, si leghi saldamente al sito attivo del recettore. Il 5-iodoindolo ha anche indotto diverse deformazioni fenotipiche nei nematodi, tra cui collasso/restringimento anomalo degli organi e aumento della vacuolizzazione. Questi risultati suggeriscono che i vacuoli potrebbero svolgere un ruolo nella morte dei nematodi mediata dalla metilazione. È importante sottolineare che il 5-iodoindolo non è risultato tossico per entrambe le specie vegetali (cavolo e ravanello). Pertanto, questo studio dimostra che l'applicazione di iodoindolo in determinate condizioni ambientali può controllare i danni causati dalla malattia del deperimento del pino.
Il nematode del legno di pino (Bursaphelenchus xylophilus) appartiene alla famiglia dei nematodi del legno di pino (PWN), nematodi endoparassiti migratori noti per causare gravi danni ecologici agli ecosistemi delle pinete1. La malattia dell'avvizzimento del pino (PWD), causata dal nematode del legno di pino, sta diventando un grave problema in diversi continenti, tra cui Asia ed Europa, e in Nord America il nematode distrugge le specie di pino introdotte1,2. Il declino dei pini rappresenta un grave problema economico e la prospettiva della sua diffusione globale è preoccupante3. Le seguenti specie di pino sono le più comunemente attaccate dal nematode: Pinus densiflora, Pinus sylvestris, Pinus thunbergii, Pinus koraiensis, Pinus thunbergii e Pinus radiata4. Il nematode del pino è una grave malattia che può uccidere i pini entro poche settimane o mesi dall'infezione. Inoltre, le epidemie di nematode del pino sono comuni in una varietà di ecosistemi, pertanto si sono instaurate catene di infezione persistenti1.
Bursaphelenchus xylophilus è un nematode fitoparassita da quarantena appartenente alla superfamiglia Aphelenchoidea e al clade 102.5. Il nematode si nutre di funghi e si riproduce nei tessuti legnosi dei pini, sviluppandosi in quattro diversi stadi larvali: L1, L2, L3, L4 e un individuo adulto1,6. In condizioni di carenza di cibo, il nematode del pino passa a uno stadio larvale specializzato – dauer – che parassita il suo vettore – il coleottero della corteccia del pino (Monochamus alternatus) – e viene trasferito su pini sani. Negli ospiti sani, i nematodi migrano rapidamente attraverso i tessuti vegetali e si nutrono di cellule parenchimatiche, causando una serie di reazioni di ipersensibilità, appassimento del pino e morte entro un anno dall'infezione1,7,8.
Il controllo biologico dei nematodi del pino rappresenta da tempo una sfida, con misure di quarantena che risalgono al XX secolo. Le attuali strategie per il controllo dei nematodi del pino prevedono principalmente trattamenti chimici, tra cui la fumigazione del legno e l'impianto di nematocidi nei tronchi degli alberi. I nematocidi più comunemente utilizzati sono l'avermectina e il benzoato di avermectina, appartenenti alla famiglia delle avermectine. Queste sostanze chimiche costose sono altamente efficaci contro molte specie di nematodi e sono considerate sicure per l'ambiente9. Tuttavia, si prevede che l'uso ripetuto di questi nematocidi crei una pressione selettiva che porterà quasi certamente all'emergere di nematodi del pino resistenti, come è stato dimostrato per diversi insetti nocivi, come Leptinotarsa decemlineata, Plutella xylostella e i nematodi Trichostrongylus colubriformis e Ostertagia circumcincta, che hanno gradualmente sviluppato resistenza alle avermectine10,11,12. Pertanto, è necessario studiare regolarmente i modelli di resistenza e sottoporre a screening continuo i nematocidi per individuare misure alternative, economicamente vantaggiose ed ecocompatibili per il controllo della PVD. Negli ultimi decenni, diversi autori hanno proposto l'utilizzo di estratti vegetali, oli essenziali e composti volatili come agenti di controllo dei nematodi13,14,15,16.
Abbiamo recentemente dimostrato l'attività nematocida dell'indolo, una molecola di segnalazione intercellulare e interregno, in Caenorhabditis elegans 17. L'indolo è un segnale intracellulare diffuso nell'ecologia microbica, che controlla numerose funzioni che influenzano la fisiologia microbica, la formazione di spore, la stabilità dei plasmidi, la resistenza ai farmaci, la formazione di biofilm e la virulenza 18, 19. L'attività dell'indolo e dei suoi derivati contro altri nematodi patogeni non è stata studiata. In questo studio, abbiamo indagato l'attività nematocida di 34 indoli contro i nematodi del pino e chiarito il meccanismo d'azione del più potente 5-iodoindolo utilizzando microscopia, fotografia time-lapse ed esperimenti di docking molecolare, e abbiamo valutato i suoi effetti tossici sulle piante utilizzando un test di germinazione dei semi.
È stato precedentemente riportato che elevate concentrazioni (>1,0 mM) di indolo hanno un effetto nematocida sui nematodi17. In seguito al trattamento di B. xylophilus (stadi di sviluppo misti) con indolo o 33 diversi derivati dell'indolo a 1 mM, la mortalità di B. xylophilus è stata misurata contando i nematodi vivi e morti nei gruppi di controllo e trattati. Cinque indoli hanno mostrato una significativa attività nematocida; la sopravvivenza del gruppo di controllo non trattato è stata del 95 ± 7% dopo 24 ore. Dei 34 indoli testati, il 5-iodoindolo e il 4-fluoroindolo a 1 mM hanno causato il 100% di mortalità, mentre il 5,6-difluoroindaco, il metilindolo-7-carbossilato e il 7-iodoindolo hanno causato circa il 50% di mortalità (Tabella 1).
Effetto del 5-iodoindolo sulla formazione di vacuoli e sul metabolismo del nematode del legno di pino. (A) Effetto dell'avermectina e del 5-iodoindolo su nematodi maschi adulti, (B) uova di nematode allo stadio L1 e (C) metabolismo di B. xylophilus, (i) i vacuoli non sono stati osservati a 0 h, il trattamento ha portato a (ii) vacuoli, (iii) accumulo di più vacuoli, (iv) rigonfiamento dei vacuoli, (v) fusione dei vacuoli e (vi) formazione di vacuoli giganti. Le frecce rosse indicano il rigonfiamento dei vacuoli, le frecce blu indicano la fusione dei vacuoli e le frecce nere indicano i vacuoli giganti. Barra di scala = 50 μm.
Inoltre, questo studio ha anche descritto il processo sequenziale di morte indotta dal metano nei nematodi del pino (Figura 4C). La morte metanogenica è un tipo di morte cellulare non apoptotica associata all'accumulo di prominenti vacuoli citoplasmatici27. I difetti morfologici osservati nei nematodi del pino sembrano essere strettamente correlati al meccanismo di morte indotta dal metano. L'esame microscopico in diversi momenti ha mostrato che si sono formati vacuoli giganti dopo 20 ore di esposizione al 5-iodoindolo (0,1 mM). Vacuoli microscopici sono stati osservati dopo 8 ore di trattamento e il loro numero è aumentato dopo 12 ore. Diversi grandi vacuoli sono stati osservati dopo 14 ore. Diversi vacuoli fusi erano chiaramente visibili dopo 12-16 ore di trattamento, indicando che la fusione dei vacuoli è alla base del meccanismo di morte metanogenica. Dopo 20 ore, diversi vacuoli giganti sono stati trovati in tutto il verme. Queste osservazioni rappresentano la prima segnalazione di metuosi in C. elegans.
Nei vermi trattati con 5-iodoindolo, sono stati osservati anche aggregazione e rottura dei vacuoli (Fig. 5), come evidenziato dalla flessione dei vermi e dal rilascio dei vacuoli nell'ambiente. La rottura dei vacuoli è stata osservata anche nella membrana del guscio d'uovo, che normalmente viene preservata intatta dalla larva L2 durante la schiusa (Fig. supplementare S2). Queste osservazioni supportano il coinvolgimento dell'accumulo di fluidi e del malfunzionamento dell'osmoregolazione, nonché del danno cellulare reversibile (RCI), nel processo di formazione e suppurazione dei vacuoli (Fig. 5).
Ipotizzando il ruolo dello iodio nella formazione di vacuoli osservata, abbiamo studiato l'attività nematocida dello ioduro di sodio (NaI) e dello ioduro di potassio (KI). Tuttavia, alle concentrazioni (0,1, 0,5 o 1 mM), non hanno influenzato né la sopravvivenza dei nematodi né la formazione di vacuoli (Figura supplementare S5), sebbene 1 mM di KI abbia avuto un leggero effetto nematocida. D'altra parte, il 7-iodoindolo (1 o 2 mM), come il 5-iodoindolo, ha indotto la formazione di vacuoli multipli e deformazioni strutturali (Figura supplementare S6). I due iodoindoli hanno mostrato caratteristiche fenotipiche simili nei nematodi del pino, mentre NaI e KI no. È interessante notare che l'indolo non ha indotto la formazione di vacuoli in B. xylophilus alle concentrazioni testate (dati non mostrati). Pertanto, i risultati hanno confermato che il complesso indolo-iodio è responsabile della vacuolizzazione e del metabolismo di B. xylophilus.
Tra gli indoli testati per l'attività nematocida, il 5-iodoindolo ha mostrato l'indice di slittamento più elevato, pari a -5,89 kcal/mol, seguito dal 7-iodoindolo (-4,48 kcal/mol), dal 4-fluoroindolo (-4,33) e dall'indolo (-4,03) (Figura 6). Il forte legame idrogeno dello scheletro del 5-iodoindolo con la leucina 218 stabilizza il suo legame, mentre tutti gli altri derivati dell'indolo si legano alla serina 260 tramite legami idrogeno della catena laterale. Tra gli altri iodoindoli modellati, il 2-iodoindolo ha un valore di legame di -5,248 kcal/mol, dovuto al suo principale legame idrogeno con la leucina 218. Altri legami noti includono il 3-iodoindolo (-4,3 kcal/mol), il 4-iodoindolo (-4,0 kcal/mol) e il 6-fluoroindolo (-2,6 kcal/mol) (Figura supplementare S8). La maggior parte degli indoli alogenati e l'indolo stesso, ad eccezione del 5-iodoindolo e del 2-iodoindolo, formano un legame con la serina 260. Il fatto che il legame idrogeno con la leucina 218 sia indicativo di un efficiente legame recettore-ligando, come osservato per l'ivermectina (Figura supplementare S7), conferma che il 5-iodoindolo e il 2-iodoindolo, come l'ivermectina, si legano saldamente al sito attivo del recettore GluCL tramite la leucina 218 (Figura 6 e Figura supplementare S8). Proponiamo che questo legame sia necessario per mantenere la struttura del poro aperto del complesso GluCL e che, legandosi saldamente al sito attivo del recettore GluCL, il 5-iodoindolo, il 2-iodoindolo, l'avermectina e l'ivermectina mantengano quindi il canale ionico aperto e consentano l'assorbimento di fluidi.
Docking molecolare dell'indolo e dell'indolo alogenato alla GluCL. Orientamenti di legame dei ligandi (A) indolo, (B) 4-fluoroindolo, (C) 7-iodoindolo e (D) 5-iodoindolo al sito attivo della GluCL. La proteina è rappresentata da un nastro e i legami idrogeno dello scheletro proteico sono mostrati come linee tratteggiate gialle. (A′), (B′), (C′) e (D′) mostrano le interazioni dei ligandi corrispondenti con i residui amminoacidici circostanti e i legami idrogeno della catena laterale sono indicati da frecce tratteggiate rosa.
Sono stati condotti esperimenti per valutare l'effetto tossico del 5-iodoindolo sulla germinazione dei semi di cavolo e ravanello. Il 5-iodoindolo (0,05 o 0,1 mM) o l'avermectina (10 μg/mL) hanno avuto un effetto minimo o nullo sulla germinazione iniziale e sull'emergenza delle plantule (Figura 7). Inoltre, non è stata riscontrata alcuna differenza significativa tra il tasso di germinazione dei controlli non trattati e dei semi trattati con 5-iodoindolo o avermectina. L'effetto sull'allungamento della radice principale e sul numero di radici laterali formate è risultato insignificante, sebbene 1 mM (10 volte la sua concentrazione attiva) di 5-iodoindolo abbia leggermente ritardato lo sviluppo delle radici laterali. Questi risultati indicano che il 5-iodoindolo non è tossico per le cellule vegetali e non interferisce con i processi di sviluppo delle piante alle concentrazioni studiate.
Effetto del 5-iodoindolo sulla germinazione dei semi. Germinazione, germogliamento e radicazione laterale dei semi di B. oleracea e R. raphanistrum su terreno agarizzato di Murashige e Skoog con o senza avermectina o 5-iodoindolo. La germinazione è stata registrata dopo 3 giorni di incubazione a 22 °C.
Questo studio riporta diversi casi di uccisione di nematodi da parte degli indoli. È importante sottolineare che si tratta della prima segnalazione di iodoindolo in grado di indurre metilazione (un processo causato dall'accumulo di piccoli vacuoli che si fondono gradualmente in vacuoli giganti, portando infine alla rottura della membrana e alla morte) negli aghi di pino, con iodoindolo che mostra significative proprietà nematocide simili a quelle dell'avermectina, un nematocida commerciale.
È stato precedentemente riportato che gli indoli esercitano molteplici funzioni di segnalazione nei procarioti e negli eucarioti, tra cui l'inibizione/formazione del biofilm, la sopravvivenza batterica e la patogenicità19,32,33,34. Recentemente, i potenziali effetti terapeutici degli indoli alogenati, degli alcaloidi indolici e dei derivati indolici semisintetici hanno attirato un ampio interesse di ricerca35,36,37. Ad esempio, è stato dimostrato che gli indoli alogenati uccidono le cellule persistenti di Escherichia coli e Staphylococcus aureus37. Inoltre, è di interesse scientifico studiare l'efficacia degli indoli alogenati contro altre specie, generi e regni, e questo studio rappresenta un passo avanti verso il raggiungimento di questo obiettivo.
Qui proponiamo un meccanismo per la letalità indotta dal 5-iodoindolo in C. elegans basato sul danno cellulare reversibile (RCI) e sulla metilazione (Figure 4C e 5). I cambiamenti edematosi come il gonfiore e la degenerazione vacuolare sono indicatori di RCI e metilazione, che si manifestano come vacuoli giganti nel citoplasma48,49. L'RCI interferisce con la produzione di energia riducendo la produzione di ATP, causando il malfunzionamento della pompa ATPasi o interrompendo le membrane cellulari e provocando un rapido afflusso di Na+, Ca2+ e acqua50,51,52. I vacuoli intracitoplasmatici si formano nelle cellule animali a seguito dell'accumulo di fluidi nel citoplasma dovuto all'afflusso di Ca2+ e acqua53. È interessante notare che questo meccanismo di danno cellulare è reversibile se il danno è temporaneo e le cellule iniziano a produrre ATP per un certo periodo di tempo, ma se il danno persiste o peggiora, le cellule muoiono.54 Le nostre osservazioni mostrano che i nematodi trattati con 5-iodoindolo non sono in grado di ripristinare la normale biosintesi dopo l'esposizione a condizioni di stress.
Il fenotipo di metilazione indotto dal 5-iodoindolo in B. xylophilus potrebbe essere dovuto alla presenza di iodio e alla sua distribuzione molecolare, poiché il 7-iodoindolo ha avuto un effetto inibitorio minore su B. xylophilus rispetto al 5-iodoindolo (Tabella 1 e Figura supplementare S6). Questi risultati sono parzialmente coerenti con gli studi di Maltese et al. (2014), i quali hanno riportato che la traslocazione della porzione di azoto piridilico nell'indolo dalla posizione para alla posizione meta ha abolito la vacuolizzazione, l'inibizione della crescita e la citotossicità nelle cellule U251, suggerendo che l'interazione della molecola con uno specifico sito attivo nella proteina è fondamentale27,44,45. Le interazioni tra indolo o indoli alogenati e i recettori GluCL osservate in questo studio supportano ulteriormente questa ipotesi, poiché è stato riscontrato che il 5- e il 2-iodoindolo si legano ai recettori GluCL più fortemente rispetto agli altri indoli esaminati (Figura 6 e Figura supplementare S8). È stato osservato che lo iodio in seconda o quinta posizione dell'indolo si lega alla leucina 218 del recettore GluCL tramite legami idrogeno dello scheletro proteico, mentre altri indoli alogenati e l'indolo stesso formano deboli legami idrogeno della catena laterale con la serina 260 (Figura 6). Ipotizziamo pertanto che la localizzazione dell'alogeno svolga un ruolo importante nell'induzione della degenerazione vacuolare, mentre il forte legame del 5-iodoindolo mantiene aperto il canale ionico, consentendo così un rapido afflusso di fluidi e la rottura del vacuolo. Tuttavia, il meccanismo d'azione dettagliato del 5-iodoindolo deve ancora essere determinato.
Prima dell'applicazione pratica del 5-iodoindolo, è necessario analizzarne l'effetto tossico sulle piante. I nostri esperimenti di germinazione dei semi hanno dimostrato che il 5-iodoindolo non ha avuto effetti negativi sulla germinazione dei semi o sui successivi processi di sviluppo alle concentrazioni studiate (Figura 7). Pertanto, questo studio fornisce una base per l'utilizzo del 5-iodoindolo in ambito ecologico per il controllo della nocività dei nematodi del pino sugli alberi di pino.
Precedenti studi hanno dimostrato che la terapia a base di indolo rappresenta un potenziale approccio per affrontare il problema della resistenza agli antibiotici e della progressione del cancro55. Inoltre, gli indoli possiedono attività antibatteriche, antitumorali, antiossidanti, antinfiammatorie, antidiabetiche, antivirali, antiproliferative e antitubercolari e possono costituire una base promettente per lo sviluppo di farmaci56,57. Questo studio suggerisce per la prima volta il potenziale utilizzo dello iodio come agente antiparassitario e antielmintico.
L'avermectina è stata scoperta trent'anni fa e ha vinto il Premio Nobel nel 2015; il suo utilizzo come antielmintico è tuttora in corso. Tuttavia, a causa del rapido sviluppo di resistenza alle avermectine nei nematodi e negli insetti nocivi, è necessaria una strategia alternativa, economica ed ecocompatibile per controllare l'infezione da nematode del pino (PWN) nei pini. Questo studio descrive anche il meccanismo con cui il 5-iodoindolo uccide i nematodi del pino e dimostra la sua bassa tossicità per le cellule vegetali, aprendo così buone prospettive per la sua futura applicazione commerciale.
Tutti gli esperimenti sono stati approvati dal Comitato Etico dell'Università di Yeungnam, Gyeongsan, Corea, e le procedure sono state eseguite in conformità con le linee guida del Comitato Etico dell'Università di Yeungnam.
Gli esperimenti di incubazione delle uova sono stati eseguiti utilizzando procedure consolidate43. Per valutare i tassi di schiusa (HR), nematodi adulti di 1 giorno (circa 100 femmine e 100 maschi) sono stati trasferiti in piastre di Petri contenenti il fungo e lasciati crescere per 24 ore. Le uova sono state quindi isolate e trattate con 5-iodoindolo (0,05 mM e 0,1 mM) o avermectina (10 μg/ml) in sospensione in acqua distillata sterile. Queste sospensioni (500 μl; circa 100 uova) sono state trasferite nei pozzetti di una piastra per colture cellulari a 24 pozzetti e incubate a 22 °C. Il conteggio delle larve L2 è stato effettuato dopo 24 ore di incubazione, ma le cellule sono state considerate morte se non si muovevano se stimolate con un filo di platino sottile. Questo esperimento è stato condotto in due fasi, ciascuna con sei ripetizioni. I dati di entrambi gli esperimenti sono stati combinati e presentati. La percentuale di HR è calcolata come segue:
La mortalità larvale è stata valutata utilizzando procedure precedentemente sviluppate. Le uova di nematode sono state raccolte e gli embrioni sono stati sincronizzati mediante schiusa in acqua distillata sterile per generare larve allo stadio L2. Le larve sincronizzate (circa 500 nematodi) sono state trattate con 5-iodoindolo (0,05 mM e 0,1 mM) o avermectina (10 μg/ml) e allevate su piastre di Petri contenenti B. cinerea. Dopo 48 ore di incubazione a 22 °C, i nematodi sono stati raccolti in acqua distillata sterile ed esaminati per la presenza degli stadi L2, L3 e L4. La presenza degli stadi L3 e L4 indicava la trasformazione larvale, mentre la presenza dello stadio L2 indicava l'assenza di trasformazione. Le immagini sono state acquisite utilizzando il sistema di imaging cellulare digitale iRiS™. Questo esperimento è stato condotto in due fasi, ciascuna con sei ripetizioni. I dati di entrambi gli esperimenti sono stati combinati e presentati.
La tossicità del 5-iodoindolo e dell'avermectina sui semi è stata valutata mediante test di germinazione su piastre di agar Murashige e Skoog.62 I semi di B. oleracea e R. raphanistrum sono stati prima immersi in acqua distillata sterile per un giorno, lavati con 1 ml di etanolo al 100%, sterilizzati con 1 ml di candeggina commerciale al 50% (ipoclorito di sodio al 3%) per 15 minuti e lavati cinque volte con 1 ml di acqua sterile. I semi sterilizzati sono stati quindi pressati su piastre di agar per germinazione contenenti 0,86 g/l (0,2X) di terreno di coltura Murashige e Skoog e 0,7% di agar batteriologico con o senza 5-iodoindolo o avermectina. Le piastre sono state quindi incubate a 22 °C e le immagini sono state scattate dopo 3 giorni di incubazione. Questo esperimento è stato condotto in due fasi, ciascuna delle quali ha avuto sei ripetizioni.
Data di pubblicazione: 26 febbraio 2025