Una serie di sperimentazioni pilota condotte in capanne sono state condotte a Khowe, nel Benin meridionale, per valutare l'efficacia biologica di zanzariere di nuova generazione, nuove e testate sul campo, contro i vettori della malaria resistenti alla piretrina. Le zanzariere, una volta utilizzate sul campo, sono state rimosse dalle abitazioni dopo 12, 24 e 36 mesi. I frammenti di rete tagliati da intere zanzariere sono stati analizzati per la composizione chimica e sono stati condotti biotest di suscettibilità durante ogni sperimentazione per valutare i cambiamenti nella resistenza agli insetticidi nella popolazione di vettori di Khowe.
Interceptor® G2 ha superato le prestazioni di altri ITN, confermando la superiorità delle reti a base di piretroidi e clorfenapir rispetto ad altri tipi di reti. Tra i nuovi prodotti, tutti gli ITN di nuova generazione hanno dimostrato una migliore bioefficacia rispetto a Interceptor®; tuttavia, l'entità di questo miglioramento si è ridotta dopo l'invecchiamento in campo a causa della minore durata dei composti non piretroidi. Questi risultati evidenziano la necessità di migliorare la persistenza insetticida degli ITN di nuova generazione.
InsetticidaLe zanzariere trattate con piretroidi (ITN) hanno svolto un ruolo fondamentale nella riduzione della morbilità e della mortalità per malaria negli ultimi 20 anni. Dal 2004, oltre 3 miliardi di ITN sono state distribuite in tutto il mondo e studi di modellizzazione suggeriscono che il 68% dei casi di malaria nell'Africa subsahariana è stato evitato tra il 2000 e il 2015. Sfortunatamente, la resistenza delle popolazioni di vettori della malaria ai piretroidi (la classe standard di insetticidi utilizzati nelle ITN) è aumentata in modo significativo, minacciando l'efficacia di questo intervento essenziale. Allo stesso tempo, i progressi nel controllo della malaria hanno subito un rallentamento a livello globale, con diversi paesi ad alta incidenza che hanno registrato un aumento dei casi di malaria dal 2015. Queste tendenze hanno guidato lo sviluppo di una nuova generazione di prodotti ITN innovativi volti ad affrontare la minaccia della resistenza ai piretroidi e a contribuire a ridurre questo onere e a raggiungere ambiziosi obiettivi globali.
Attualmente sono disponibili sul mercato tre zanzariere di nuova generazione, ciascuna delle quali combina un piretroide con un altro insetticida o sinergizzante in grado di superare la resistenza ai piretroidi nei vettori della malaria. Negli ultimi anni, sono stati condotti diversi studi clinici randomizzati a grappolo (RCT) per valutare l'efficacia epidemiologica di queste zanzariere rispetto alle zanzariere standard contenenti solo piretroidi e per fornire le prove necessarie a supporto delle raccomandazioni dell'Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS). Le zanzariere da letto che combinano piretroidi con piperonil butossido (PBO), un sinergizzante che aumenta l'efficacia dei piretroidi inibendo gli enzimi di detossificazione delle zanzare, sono state le prime a essere raccomandate dall'OMS dopo che due prodotti (Olyset® Plus e PermaNet® 3.0) hanno dimostrato un impatto epidemiologico superiore rispetto alle zanzariere da letto contenenti solo piretroidi in studi clinici randomizzati a grappolo in Tanzania e Uganda. Tuttavia, sono necessari più dati per determinare il valore per la salute pubblica delle zanzariere da letto con piretroidi-PBO nell'Africa occidentale, dove la forte resistenza ai piretroidi potrebbe ridurne i benefici rispetto alle zanzariere da letto con solo piretroidi.
La persistenza insetticida delle zanzariere infestanti viene in genere valutata raccogliendo periodicamente zanzariere dalle comunità e testandole in biotest di laboratorio utilizzando ceppi di zanzare allevati da insetti. Sebbene questi test siano utili per caratterizzare la biodisponibilità e l'efficacia degli insetticidi sulla superficie delle zanzariere nel tempo, forniscono informazioni limitate sull'efficacia comparativa di diversi tipi di zanzariere di nuova generazione, poiché i metodi e i ceppi di zanzara utilizzati devono essere adattati alla modalità d'azione degli insetticidi in essi contenuti. Il test sperimentale della capanna è un approccio alternativo che può essere utilizzato per valutare comparativamente l'efficacia delle zanzariere trattate con insetticidi in studi di durabilità in condizioni che imitano le interazioni naturali tra ospiti di zanzare selvatiche e zanzariere domestiche durante l'uso. Infatti, recenti studi di modellazione che utilizzano surrogati entomologici per i dati epidemiologici hanno dimostrato che la mortalità delle zanzare e i tassi di alimentazione misurati in questi studi possono essere utilizzati per prevedere l'impatto delle zanzariere infestanti sull'incidenza e la prevalenza della malaria in studi clinici randomizzati a cluster. Pertanto, le sperimentazioni basate su capanne in cui i linfonodi trattati con insetticidi raccolti sul campo vengono inclusi in RCT a grappolo possono fornire dati preziosi sulla bioefficacia comparativa e sulla persistenza insetticida dei linfonodi trattati con insetticidi durante la loro prevista durata di vita e aiutare a interpretare i risultati epidemiologici di questi studi.
Il test della capanna sperimentale è una simulazione standardizzata di un ambiente abitativo umano, raccomandata dall'Organizzazione Mondiale della Sanità per valutare l'efficacia delle zanzariere trattate con insetticidi. Questi test replicano le reali condizioni di esposizione che le zanzare incontrano quando interagiscono con le zanzariere da letto domestiche e rappresentano quindi un approccio altamente appropriato per valutare l'efficacia biologica delle zanzariere da letto usate durante la loro prevista durata di vita.
Questo studio ha valutato l'efficacia entomologica di tre diversi tipi di zanzariere insetticide di nuova generazione (PermaNet® 3.0, Royal Guard® e Interceptor® G2) in condizioni di campo in capannoni sperimentali e le ha confrontate con una zanzariera standard a base di sola piretrina (Interceptor®). Tutte queste zanzariere trattate con insetticida sono incluse nell'elenco prequalificato dall'OMS per il controllo dei vettori. Di seguito sono riportate le caratteristiche dettagliate di ciascuna zanzariera:
Nel marzo 2020, è stata condotta una campagna di distribuzione su larga scala di zanzariere invecchiate sul campo nei villaggi di capanne nella prefettura di Zou, nel Benin meridionale, per prove pilota nelle capanne. Le zanzariere da letto Interceptor®, Royal Guard® e Interceptor® G2 sono state selezionate da cluster selezionati casualmente nei comuni di Kove, Zagnanado e Ouinhi come parte di uno studio osservazionale sulla durabilità inserito in un cluster RCT per valutare l'efficacia epidemiologica delle zanzariere da letto trattate con doppio insetticida. Le zanzariere PermaNet® 3.0 sono state raccolte nel villaggio di Avokanzun vicino ai comuni di Jija e Bohicon (7°20′ N, 1°56′ E) e distribuite simultaneamente alle zanzariere a cluster RCT durante la campagna di massa del 2020 del Programma Nazionale di Controllo della Malaria. La Figura 1 mostra le posizioni dei cluster/villaggi dello studio in cui sono stati raccolti i diversi tipi di ITN rispetto ai siti delle capanne sperimentali.
È stata condotta una prova pilota in capannone per confrontare le prestazioni entomologiche di Interceptor®, PermaNet® 3.0, Royal Guard® e Interceptor® G2 ITN una volta rimosse dalle abitazioni a 12, 24 e 36 mesi dalla disseminazione. A ogni punto temporale annuale, le prestazioni delle ITN invecchiate in campo sono state confrontate con quelle di reti nuove e non utilizzate di ciascun tipo e di reti non trattate come controllo negativo. A ogni punto temporale annuale, un totale di 54 campioni replicati di ITN invecchiate in campo e 6 nuove ITN di ciascun tipo sono stati testati in 1 o 2 prove replicate in capannone con rotazione giornaliera dei trattamenti. Prima di ogni prova in capannone, è stato misurato l'indice di porosità medio delle reti invecchiate in campo di ciascun tipo di ITN secondo le raccomandazioni dell'OMS. Per simulare l'usura dovuta all'uso quotidiano, tutte le nuove ITN e le reti di controllo non trattate sono state perforate con sei fori da 4 x 4 cm: due in ciascun pannello laterale lungo e uno in ciascun pannello laterale corto, in conformità con le raccomandazioni dell'OMS. La zanzariera è stata installata all'interno della capanna legando i bordi dei teli del tetto con delle corde a chiodi negli angoli superiori delle pareti della capanna. In ogni esperimento sono stati valutati i seguenti trattamenti:
Le zanzariere invecchiate sul campo sono state valutate in capanne sperimentali nello stesso anno in cui sono state rimosse. Le prove nelle capanne sono state condotte nello stesso sito da maggio a settembre 2021, da aprile a giugno 2022 e da maggio a luglio 2023, con le zanzariere rimosse rispettivamente dopo 12, 24 e 36 mesi. Ogni prova è durata un ciclo di trattamento completo (54 notti in 9 settimane), ad eccezione di 12 mesi, quando sono stati condotti due cicli di trattamento consecutivi per aumentare la dimensione del campione di zanzare. Seguendo uno schema a quadrato latino, i trattamenti sono stati ruotati settimanalmente tra le capanne sperimentali per controllare gli effetti della posizione delle capanne, mentre i volontari sono stati ruotati quotidianamente per controllare le differenze nell'attrattiva delle zanzare dei singoli ospiti. Le zanzare sono state raccolte 6 giorni a settimana; il settimo giorno, prima del successivo ciclo di rotazione, le capanne sono state pulite e ventilate per prevenire l'infestazione.
Gli endpoint primari di efficacia per il trattamento sperimentale in capanna contro le zanzare Anopheles gambiae resistenti ai piretroidi e il confronto tra la rete ITN di nuova generazione e la rete Interceptor® contenente solo piretroidi sono stati:
Gli endpoint secondari di efficacia per il trattamento sperimentale con capanne contro le zanzare Anopheles gambiae resistenti ai piretroidi erano i seguenti:
Contenimento (%) – riduzione del tasso di ingresso nel gruppo trattato rispetto al gruppo non trattato. Il calcolo è il seguente:
dove Tu è il numero di zanzare incluse nel gruppo di controllo non trattato e Tt è il numero di zanzare incluse nel gruppo trattato.
Tasso di abbandono (%) – Tasso di abbandono dovuto a potenziale irritazione dovuta al trattamento, espresso come percentuale di zanzare raccolte sul balcone.
Il coefficiente di soppressione delle zanzare ematofaghe (%) è la riduzione della percentuale di zanzare ematofaghe nel gruppo trattato rispetto al gruppo di controllo non trattato. Il metodo di calcolo è il seguente: dove Bfu è la percentuale di zanzare ematofaghe nel gruppo di controllo non trattato e Bft è la percentuale di zanzare ematofaghe nel gruppo trattato.
Riduzione della fertilità (%): la riduzione della percentuale di zanzare fertili nel gruppo trattato rispetto al gruppo di controllo non trattato. Il metodo di calcolo è il seguente: dove Fu è la percentuale di zanzare fertili nel gruppo di controllo non trattato e Ft è la percentuale di zanzare fertili nel gruppo trattato.
Per monitorare i cambiamenti nel profilo di resistenza delle popolazioni di vettori Covè nel tempo, l'OMS ha condotto biotest in vitro e in fiale nello stesso anno di ogni prova sperimentale in capannone (2021, 2022, 2023) per valutare la suscettibilità all'influenza aviaria nelle zanzare infestanti in studio e per orientare l'interpretazione dei risultati. Negli studi in vitro, le zanzare sono state esposte a carte da filtro trattate con concentrazioni definite di alfa-cipermetrina (0,05%) e deltametrina (0,05%) e a flaconi rivestiti con concentrazioni definite di CFP (100 μg/flacone) e PPF (100 μg/flacone) per valutare la suscettibilità a questi insetticidi. L'intensità della resistenza ai piretroidi è stata studiata esponendo le zanzare a concentrazioni differenziali di α-cipermetrina e deltametrina pari a 5 volte (0,25%) e 10 volte (0,50%). Infine, il contributo della sinergia del PBO e della sovraespressione della citocromo P450 monoossigenasi (P450) alla resistenza ai piretroidi è stato valutato pre-esponendo le zanzare a concentrazioni differenziali di α-cipermetrina (0,05%) e deltametrina (0,05%) e pre-esposizione al PBO (4%). La carta da filtro utilizzata per il test in provetta dell'OMS è stata acquistata dall'Universiti Sains Malaysia. Le fiale per il test biologico dell'OMS utilizzando CFP e PPF sono state preparate secondo le raccomandazioni dell'OMS.
Le zanzare utilizzate per i biotest sono state raccolte allo stadio larvale da siti di riproduzione vicini alle capanne sperimentali e poi allevate fino allo stadio adulto. A ogni punto temporale, almeno 100 zanzare sono state esposte a ciascun trattamento per 60 minuti, con 4 repliche per provetta/flacone e circa 25 zanzare per provetta/flacone. Per l'esposizione a piretroidi e CFP, sono state utilizzate zanzare di 3-5 giorni di età non nutrite, mentre per l'esposizione a PPF, sono state utilizzate zanzare ematofaghe di 5-7 giorni di età per stimolare l'oogenesi e valutare l'effetto del PPF sulla riproduzione delle zanzare. Esposizioni parallele sono state condotte utilizzando carta da filtro impregnata di olio di silicone, PBO puro (4%) e flaconi rivestiti di acetone come controlli. Al termine dell'esposizione, le zanzare sono state trasferite in contenitori non trattati ed esposte a cotone idrofilo imbevuto di soluzione glucosata al 10% (p/v). La mortalità è stata registrata 24 ore dopo l'esposizione a piretroidi e ogni 24 ore per 72 ore dopo l'esposizione a CFP e PPF. Per valutare la suscettibilità al PPF, le zanzare sopravvissute esposte al PPF e i corrispondenti controlli negativi sono stati sezionati dopo aver registrato la mortalità ritardata, lo sviluppo ovarico è stato osservato utilizzando un microscopio composto e la fertilità è stata valutata in base allo stadio di Christophers dello sviluppo delle uova [28, 30]. Se le uova si sviluppavano completamente fino allo stadio V di Christophers, le zanzare venivano classificate come fertili e se le uova non erano completamente sviluppate e rimanevano agli stadi I-IV, le zanzare venivano classificate come sterili.
In ogni momento dell'anno, pezzi di 30 × 30 cm sono stati tagliati da reti nuove e invecchiate sul campo nei punti specificati nelle raccomandazioni dell'OMS [22]. Dopo il taglio, le reti sono state etichettate, avvolte in un foglio di alluminio e conservate in frigorifero a 4 ± 2 °C per impedire la migrazione dell'IA nel tessuto. Le reti sono state quindi inviate al Centro Vallone di Ricerca Agricola in Belgio per analisi chimiche volte a misurare le variazioni del contenuto totale di IA durante la loro vita utile. I metodi analitici utilizzati (basati sui metodi raccomandati dal Comitato Cooperativo Internazionale per l'Analisi dei Pesticidi) sono stati descritti in precedenza [25, 31].
Per i dati della prova sperimentale in capanne, il numero totale di zanzare vive/morte, pungenti/non pungenti e fertili/sterili nei diversi compartimenti delle capanne è stato sommato per ciascun trattamento in ogni prova per calcolare i vari esiti proporzionali (mortalità a 72 ore, punture, ectoparassitismo, intrappolamento nella rete, fertilità) e i corrispondenti intervalli di confidenza (IC) al 95%. Le differenze tra i trattamenti per questi esiti binari proporzionali sono state analizzate utilizzando la regressione logistica, mentre le differenze per gli esiti di conteggio sono state analizzate utilizzando la regressione binomiale negativa. Poiché sono stati condotti due cicli di rotazione del trattamento ogni 12 mesi e alcuni trattamenti sono stati testati in più prove, le analisi di penetrazione delle zanzare sono state aggiustate per il numero di giorni di test di ciascun trattamento. È stato inoltre analizzato il nuovo ITN per ciascun esito per ottenere una stima univoca per tutti i punti temporali. Oltre alla principale variabile esplicativa del trattamento, ciascun modello includeva capanna, persona che dorme, periodo di prova, indice di apertura ITN e giorno come effetti fissi per controllare la variazione dovuta a differenze nell'attrattività di persona che dorme e capanna, stagionalità, stato della zanzariera ed eccessiva dispersione. Le analisi di regressione hanno prodotto odds ratio (OR) aggiustati e corrispondenti intervalli di confidenza al 95% per stimare l'effetto della zanzariera ITN di nuova generazione rispetto alla zanzariera a base di solo piretroide, Interceptor®, sugli esiti primari di mortalità e fecondità delle zanzare. I valori di p dei modelli sono stati utilizzati anche per assegnare lettere compatte che indicano la significatività statistica al livello del 5% per tutti i confronti a coppie degli esiti primari e secondari. Tutte le analisi di regressione sono state eseguite in Stata versione 18.
La suscettibilità delle popolazioni di vettori Covese è stata interpretata sulla base della mortalità e della fecondità osservate in vitro e nei biotest in bottiglia, secondo le raccomandazioni dell'Organizzazione Mondiale della Sanità. I risultati delle analisi chimiche hanno fornito il contenuto totale di IA nei frammenti di ITN, che è stato utilizzato per calcolare il tasso di ritenzione dell'IA nelle reti invecchiate in campo rispetto alle reti nuove in ogni momento di ogni anno. Tutti i dati sono stati registrati manualmente su moduli standardizzati e quindi inseriti due volte in un database Microsoft Excel.
I Comitati Etici del Ministero della Salute del Benin (n. 6/30/MS/DC/DRFMT/CNERS/SA), della London School of Hygiene & Tropical Medicine (LSHTM) (n. 16237) e dell'Organizzazione Mondiale della Sanità (n. ERC.0003153) hanno approvato la conduzione di uno studio pilota in una capanna di legno su volontari. Il consenso informato scritto è stato ottenuto da tutti i volontari prima della partecipazione allo studio. Tutti i volontari hanno ricevuto chemioprofilassi gratuita per ridurre il rischio di malaria e un infermiere è stato in servizio per tutta la durata dello studio per valutare qualsiasi volontario che sviluppasse sintomi di febbre o una reazione avversa al prodotto in esame.
I risultati completi delle capanne sperimentali, che riassumono il numero totale di zanzare vive/morte, affamate/nutrite con sangue e fertili/sterili per ciascun gruppo sperimentale, nonché le statistiche descrittive, sono presentati come materiale supplementare (Tabella S1).
In una capanna sperimentale a Kowa, in Benin, è stata soppressa l'alimentazione ematica delle zanzare selvatiche Anopheles gambiae resistenti ai piretroidi. I dati dei controlli non trattati e delle nuove zanzariere sono stati aggregati tra le diverse sperimentazioni per fornire una stima di efficacia univoca. Mediante analisi di regressione logistica, le colonne con lettere comuni non presentavano differenze significative al livello del 5% (p > 0,05). Le barre di errore rappresentano intervalli di confidenza al 95%.
Mortalità delle zanzare selvatiche Anopheles gambiae resistenti ai piretroidi in ingresso in una capanna sperimentale a Kowa, Benin. I dati dei controlli non trattati e delle nuove zanzariere sono stati aggregati tra le diverse sperimentazioni per fornire una stima univoca dell'efficacia. Mediante analisi di regressione logistica, le colonne con lettere comuni non presentavano differenze significative al livello del 5% (p > 0,05). Le barre di errore rappresentano intervalli di confidenza al 95%.
L'odds ratio descrive la differenza di mortalità tra le zanzariere di nuova generazione e quelle con solo piretroide. La linea tratteggiata rappresenta un odds ratio pari a 1, che indica l'assenza di differenze di mortalità. Un odds ratio > 1 indica una mortalità più elevata con le zanzariere di nuova generazione. I dati relativi alle zanzariere di nuova generazione sono stati aggregati tra gli studi per produrre un'unica stima di efficacia. Le barre di errore rappresentano intervalli di confidenza al 95%.
Sebbene Interceptor® abbia dimostrato la mortalità più bassa tra tutte le reti antiparassitarie testate, l'invecchiamento in campo non ha avuto un impatto negativo sulla mortalità dei vettori. Infatti, le nuove reti Interceptor® hanno determinato una mortalità del 12%, mentre le reti invecchiate in campo hanno mostrato un leggero miglioramento a 12 mesi (17%, p=0,006) e 24 mesi (17%, p=0,004), prima di tornare a livelli simili a quelli delle reti nuove a 36 mesi (11%, p=0,05). Al contrario, i tassi di mortalità per la generazione successiva di reti trattate con insetticida sono gradualmente diminuiti nel tempo dopo l'installazione. La riduzione è stata più pronunciata con Interceptor® G2, dove la mortalità è diminuita dal 58% con le nuove maglie al 36% a 12 mesi (p< 0,001), 31% a 24 mesi (p< 0,001) e il 20% a 36 mesi (p< 0,001). Il nuovo PermaNet® 3.0 ha portato a una riduzione della mortalità al 37%, che è diminuita significativamente anche al 20% a 12 mesi (p< 0,001), 16% a 24 mesi (p< 0,001) e il 18% a 36 mesi (p< 0,001). Una tendenza simile è stata osservata con Royal Guard®, con la nuova rete che ha portato a una riduzione del 33% della mortalità, seguita da una significativa riduzione al 21% a 12 mesi (p< 0,001), 17% a 24 mesi (p< 0,001) e il 15% a 36 mesi (p< 0,001).
Riduzione della fecondità delle zanzare selvatiche Anopheles gambiae resistenti ai piretroidi che entrano in una capanna sperimentale a Kwa, Benin. I dati dei controlli non trattati e delle nuove zanzariere sono stati aggregati tra le prove per fornire una stima univoca dell'efficacia. Le barre con lettere comuni non presentavano differenze significative al livello del 5% (p > 0,05) mediante analisi di regressione logistica. Le barre di errore rappresentano intervalli di confidenza al 95%.
Gli odds ratio descrivono la differenza di fertilità tra le zanzariere di nuova generazione e quelle con solo piretroide. La linea tratteggiata rappresenta un rapporto pari a 1, che indica l'assenza di differenze di fertilità.< 1 indica una maggiore riduzione della fertilità con le zanzariere di nuova generazione. I dati relativi alle zanzariere di nuova generazione sono stati aggregati tra le diverse sperimentazioni per produrre una stima univoca dell'efficacia. Le barre di errore rappresentano intervalli di confidenza del 95%.
Data di pubblicazione: 17-02-2025