Una serie di studi pilota condotti in capanne sono stati effettuati a Khowe, nel Benin meridionale, per valutare l'efficacia biologica di zanzariere di nuova generazione, nuove e già testate sul campo, contro i vettori della malaria resistenti alle piretrine. Le zanzariere, dopo un lungo periodo di utilizzo sul campo, sono state rimosse dalle abitazioni dopo 12, 24 e 36 mesi. Frammenti di tessuto tagliati da zanzariere intere sono stati analizzati per determinarne la composizione chimica e, durante ogni studio, sono stati condotti test di suscettibilità per valutare i cambiamenti nella resistenza agli insetticidi nella popolazione di vettori di Khowe.
Interceptor® G2 ha superato le prestazioni delle altre zanzariere trattate con insetticida (ITN), confermando la superiorità delle zanzariere a base di piretroidi e clorfenapyr rispetto ad altri tipi di zanzariere. Tra i nuovi prodotti, tutte le ITN di nuova generazione hanno dimostrato una migliore bioefficacia rispetto a Interceptor®; tuttavia, l'entità di questo miglioramento si è ridotta dopo l'invecchiamento sul campo a causa della minore durata dei composti non piretroidi. Questi risultati evidenziano la necessità di migliorare la persistenza insetticida delle ITN di nuova generazione.
InsetticidaLe zanzariere trattate con piretroidi (ITN) hanno svolto un ruolo cruciale nella riduzione della morbilità e della mortalità da malaria negli ultimi 20 anni. Dal 2004, sono state distribuite in tutto il mondo oltre 3 miliardi di ITN e studi di modellizzazione suggeriscono che il 68% dei casi di malaria nell'Africa subsahariana è stato evitato tra il 2000 e il 2015. Purtroppo, la resistenza delle popolazioni di vettori della malaria ai piretroidi (la classe standard di insetticidi utilizzati nelle ITN) è aumentata significativamente, minacciando l'efficacia di questo intervento essenziale. Allo stesso tempo, i progressi nel controllo della malaria hanno subito un rallentamento a livello globale, con diversi paesi ad alta incidenza che hanno registrato un aumento dei casi di malaria dal 2015. Queste tendenze hanno spinto allo sviluppo di una nuova generazione di prodotti ITN innovativi, volti ad affrontare la minaccia della resistenza ai piretroidi e a contribuire a ridurre questo problema e a raggiungere ambiziosi obiettivi globali.
Attualmente sul mercato sono disponibili tre nuove generazioni di zanzariere trattate con insetticida (ITN), ognuna delle quali combina un piretroide con un altro insetticida o sinergizzante in grado di superare la resistenza ai piretroidi nei vettori della malaria. Negli ultimi anni, sono stati condotti numerosi studi clinici randomizzati controllati (RCT) a gruppi per valutare l'efficacia epidemiologica di queste zanzariere rispetto alle zanzariere standard contenenti solo piretroidi e per fornire le prove necessarie a supporto delle raccomandazioni dell'Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS). Le zanzariere che combinano i piretroidi con il piperonil butossido (PBO), un sinergizzante che potenzia l'efficacia dei piretroidi inibendo gli enzimi di detossificazione delle zanzare, sono state le prime ad essere raccomandate dall'OMS dopo che due prodotti (Olyset® Plus e PermaNet® 3.0) hanno dimostrato un impatto epidemiologico superiore rispetto alle zanzariere contenenti solo piretroidi in studi clinici randomizzati controllati a gruppi condotti in Tanzania e Uganda. Tuttavia, sono necessari ulteriori dati per determinare il valore per la salute pubblica delle zanzariere trattate con piretroidi e PBO nell'Africa occidentale, dove la grave resistenza ai piretroidi potrebbe ridurne i benefici rispetto alle zanzariere trattate solo con piretroidi.
La persistenza insetticida delle zanzariere trattate con insetticidi (ITN) viene in genere valutata raccogliendo periodicamente le zanzariere dalle comunità e testandole in bioassay di laboratorio utilizzando ceppi di zanzare allevati su insetti. Sebbene questi test siano utili per caratterizzare la biodisponibilità e l'efficacia degli insetticidi sulla superficie delle zanzariere nel tempo, forniscono informazioni limitate sull'efficacia comparativa di diversi tipi di zanzariere di nuova generazione, poiché i metodi e i ceppi di zanzare utilizzati devono essere adattati al meccanismo d'azione degli insetticidi in esse contenuti. Il test sperimentale in capanna è un approccio alternativo che può essere utilizzato per valutare comparativamente l'efficacia delle zanzariere trattate con insetticidi in studi di durabilità in condizioni che simulano le interazioni naturali tra le zanzare selvatiche e le zanzariere domestiche durante l'uso. Infatti, recenti studi di modellizzazione che utilizzano surrogati entomologici per i dati epidemiologici hanno dimostrato che la mortalità delle zanzare e i tassi di alimentazione misurati in questi studi possono essere utilizzati per prevedere l'impatto delle ITN sull'incidenza e la prevalenza della malaria in studi clinici randomizzati a cluster. Pertanto, studi sperimentali condotti in capanne, in cui i linfonodi trattati con insetticidi e raccolti sul campo vengono inclusi in studi clinici randomizzati a gruppi, possono fornire dati preziosi sulla bioefficacia comparativa e sulla persistenza insetticida dei linfonodi trattati con insetticidi durante la loro vita utile prevista, e contribuire all'interpretazione dei risultati epidemiologici di questi studi.
Il test sperimentale in capanna è una simulazione standardizzata di abitazione umana raccomandata dall'Organizzazione Mondiale della Sanità per valutare l'efficacia delle zanzariere trattate con insetticidi. Questi test riproducono le condizioni di esposizione reali che le zanzare infestanti incontrano interagendo con le zanzariere domestiche e rappresentano quindi un approccio altamente appropriato per valutare l'efficacia biologica delle zanzariere usate durante la loro vita utile prevista.
Questo studio ha valutato l'efficacia entomologica di tre diversi tipi di zanzariere insetticide di nuova generazione (PermaNet® 3.0, Royal Guard® e Interceptor® G2) in condizioni di campo in stalle sperimentali e le ha confrontate con una zanzariera standard trattata solo con piretrine (Interceptor®). Tutte queste zanzariere trattate con insetticidi sono incluse nell'elenco prequalificato dell'OMS per il controllo dei vettori. Le caratteristiche dettagliate di ciascuna zanzariera sono fornite di seguito:
Nel marzo 2020, è stata condotta una campagna di distribuzione su larga scala di zanzariere stagionate sul campo nei villaggi di capanne nella prefettura di Zou, nel Benin meridionale, per prove pilota nelle capanne. Le zanzariere Interceptor®, Royal Guard® e Interceptor® G2 sono state selezionate da cluster scelti casualmente nei comuni di Kove, Zagnanado e Ouinhi nell'ambito di uno studio osservazionale sulla durabilità, inserito all'interno di uno studio clinico randomizzato a cluster, per valutare l'efficacia epidemiologica delle zanzariere trattate con doppio insetticida. Le zanzariere PermaNet® 3.0 sono state raccolte nel villaggio di Avokanzun, vicino ai comuni di Jija e Bohicon (7°20′ N, 1°56′ E) e distribuite simultaneamente con le zanzariere del cluster RCT durante la campagna di massa del 2020 del Programma Nazionale di Controllo della Malaria. La Figura 1 mostra l'ubicazione dei cluster/villaggi di studio in cui sono stati raccolti i diversi tipi di zanzariere trattate con insetticida rispetto ai siti sperimentali nelle capanne.
È stata condotta una sperimentazione pilota in capanne per confrontare le prestazioni entomologiche delle zanzariere trattate con insetticida (ITN) Interceptor®, PermaNet® 3.0, Royal Guard® e Interceptor® G2, rimosse dalle abitazioni a 12, 24 e 36 mesi dalla distribuzione. In ciascun punto temporale annuale, le prestazioni delle ITN invecchiate sul campo sono state confrontate con quelle di zanzariere nuove e non utilizzate di ciascun tipo e con zanzariere non trattate come controllo negativo. In ciascun punto temporale annuale, un totale di 54 campioni replicati di ITN invecchiate sul campo e 6 ITN nuove di ciascun tipo sono stati testati in 1 o 2 prove replicate in capanne con rotazione giornaliera dei trattamenti. Prima di ogni prova in capanna, l'indice di porosità medio delle zanzariere invecchiate sul campo di ciascun tipo di ITN è stato misurato secondo le raccomandazioni dell'OMS. Per simulare l'usura dovuta all'uso quotidiano, tutte le ITN nuove e le zanzariere di controllo non trattate sono state perforate con sei fori di 4 x 4 cm: due in ciascun pannello laterale lungo e uno in ciascun pannello laterale corto, in conformità con le raccomandazioni dell'OMS. La zanzariera è stata installata all'interno della capanna fissando i bordi dei pannelli del tetto con delle corde a dei chiodi posti negli angoli superiori delle pareti. In ogni prova condotta nella capanna sono stati valutati i seguenti trattamenti:
Le zanzariere invecchiate sul campo sono state valutate in capanne sperimentali nello stesso anno in cui sono state rimosse. Le prove nelle capanne sono state condotte nello stesso sito da maggio a settembre 2021, da aprile a giugno 2022 e da maggio a luglio 2023, con la rimozione delle zanzariere dopo 12, 24 e 36 mesi, rispettivamente. Ogni prova è durata per un ciclo di trattamento completo (54 notti in 9 settimane), ad eccezione di 12 mesi, quando sono stati condotti due cicli di trattamento consecutivi per aumentare la dimensione del campione di zanzare. Seguendo un disegno a quadrato latino, i trattamenti sono stati ruotati settimanalmente tra le capanne sperimentali per controllare gli effetti della posizione delle capanne, mentre i volontari sono stati ruotati giornalmente per controllare le differenze nell'attrattività delle zanzare da parte dei singoli ospiti. Le zanzare sono state raccolte 6 giorni a settimana; il settimo giorno, prima del successivo ciclo di rotazione, le capanne sono state pulite e ventilate per prevenire l'infestazione.
Gli endpoint primari di efficacia per il trattamento sperimentale con capanne contro le zanzare Anopheles gambiae resistenti ai piretroidi e il confronto tra la zanzariera trattata con insetticida di nuova generazione e la zanzariera Interceptor®, resistente solo ai piretroidi, erano:
Gli endpoint secondari di efficacia per il trattamento sperimentale con capanne contro le zanzare Anopheles gambiae resistenti ai piretroidi erano i seguenti:
Contenimento (%) – riduzione del tasso di ingresso nel gruppo trattato rispetto al gruppo non trattato. Il calcolo è il seguente:
dove Tu è il numero di zanzare incluse nel gruppo di controllo non trattato e Tt è il numero di zanzare incluse nel gruppo trattato.
Tasso di abbandono (%) – Tasso di abbandono dovuto alla potenziale irritazione causata dal trattamento, espresso come proporzione di zanzare raccolte sul balcone.
Il coefficiente di soppressione dell'ematofagia (%) rappresenta la riduzione della proporzione di zanzare ematofaghe nel gruppo trattato rispetto al gruppo di controllo non trattato. Il metodo di calcolo è il seguente: dove Bfu è la proporzione di zanzare ematofaghe nel gruppo di controllo non trattato e Bft è la proporzione di zanzare ematofaghe nel gruppo trattato.
Riduzione della fertilità (%) — la riduzione della proporzione di zanzare fertili nel gruppo trattato rispetto al gruppo di controllo non trattato. Il metodo di calcolo è il seguente: dove Fu è la proporzione di zanzare fertili nel gruppo di controllo non trattato e Ft è la proporzione di zanzare fertili nel gruppo trattato.
Per monitorare nel tempo le variazioni del profilo di resistenza delle popolazioni di vettori di Covè, l'OMS ha condotto bioassay in vitro e in provetta nello stesso anno di ciascuna sperimentazione in capanna (2021, 2022, 2023) per valutare la suscettibilità all'influenza aviaria nelle zanzariere trattate con insetticida (ITN) oggetto di studio e per fornire informazioni utili all'interpretazione dei risultati. Negli studi in vitro, le zanzare sono state esposte a carte da filtro trattate con concentrazioni definite di alfa-cipermetrina (0,05%) e deltametrina (0,05%) e a bottiglie rivestite con concentrazioni definite di CFP (100 μg/bottiglia) e PPF (100 μg/bottiglia) per valutare la suscettibilità a questi insetticidi. L'intensità della resistenza ai piretroidi è stata studiata esponendo le zanzare a concentrazioni differenziali di α-cipermetrina e deltametrina pari a 5 volte (0,25%) e 10 volte (0,50%). Infine, il contributo della sinergia del PBO e della sovraespressione della monoossigenasi del citocromo P450 (P450) alla resistenza ai piretroidi è stato valutato pre-esponendo le zanzare a concentrazioni differenziali di α-cipermetrina (0,05%) e deltametrina (0,05%) e pre-esponendole al PBO (4%). La carta da filtro utilizzata per il test in provetta dell'OMS è stata acquistata dall'Universiti Sains Malaysia. Le fiale per il bioassay dell'OMS, utilizzando CFP e PPF, sono state preparate secondo le raccomandazioni dell'OMS.
Le zanzare utilizzate per i bioassay sono state raccolte allo stadio larvale nei siti di riproduzione vicino alle capanne sperimentali e poi allevate fino allo stadio adulto. Ad ogni punto temporale, almeno 100 zanzare sono state esposte a ciascun trattamento per 60 minuti, con 4 repliche per provetta/bottiglia e circa 25 zanzare per provetta/bottiglia. Per le esposizioni a piretroidi e CFP, sono state utilizzate zanzare non nutrite di 3-5 giorni, mentre per il PPF sono state utilizzate zanzare ematofaghe di 5-7 giorni per stimolare l'oogenesi e valutare l'effetto del PPF sulla riproduzione delle zanzare. Esposizioni parallele sono state condotte utilizzando carta da filtro impregnata di olio di silicone, PBO puro (4%) e bottiglie rivestite di acetone come controlli. Al termine dell'esposizione, le zanzare sono state trasferite in contenitori non trattati ed esposte a cotone idrofilo imbevuto in una soluzione di glucosio al 10% (p/v). La mortalità è stata registrata 24 ore dopo l'esposizione ai piretroidi e ogni 24 ore per 72 ore dopo l'esposizione a CFP e PPF. Per valutare la suscettibilità al PPF, le zanzare sopravvissute esposte al PPF e i corrispondenti controlli negativi sono stati dissezionati dopo che è stata registrata la mortalità ritardata, lo sviluppo ovarico è stato osservato utilizzando un microscopio composto e la fertilità è stata valutata secondo lo stadio di Christophers dello sviluppo delle uova [28, 30]. Se le uova si sviluppavano completamente fino allo stadio V di Christophers, le zanzare venivano classificate come fertili, e se le uova non erano completamente sviluppate e rimanevano agli stadi I-IV, le zanzare venivano classificate come sterili.
In ogni momento dell'anno, sono stati tagliati pezzi di 30 × 30 cm da reti nuove e invecchiate sul campo nei luoghi specificati nelle raccomandazioni dell'OMS [22]. Dopo il taglio, le reti sono state etichettate, avvolte in un foglio di alluminio e conservate in frigorifero a 4 ± 2 °C per impedire la migrazione dell'AI nel tessuto. Le reti sono state quindi inviate al Centro di ricerca agricola vallone in Belgio per l'analisi chimica al fine di misurare le variazioni del contenuto totale di AI durante la loro vita utile. I metodi analitici utilizzati (basati sui metodi raccomandati dal Comitato di cooperazione internazionale per l'analisi dei pesticidi) sono stati descritti in precedenza [25, 31].
Per i dati sperimentali relativi alle capanne, il numero totale di zanzare vive/morte, pungenti/non pungenti e fertili/sterili nei diversi compartimenti delle capanne è stato sommato per ciascun trattamento in ogni prova per calcolare i vari risultati proporzionali (mortalità a 72 ore, punture, ectoparassitismo, intrappolamento nelle reti, fertilità) e i corrispondenti intervalli di confidenza al 95% (IC). Le differenze tra i trattamenti per questi risultati binari proporzionali sono state analizzate utilizzando la regressione logistica, mentre le differenze per i risultati di conteggio sono state analizzate utilizzando la regressione binomiale negativa. Poiché sono stati condotti due cicli di rotazione dei trattamenti ogni 12 mesi e alcuni trattamenti sono stati testati in più prove, le analisi di penetrazione delle zanzare sono state aggiustate per il numero di giorni in cui ciascun trattamento è stato testato. La nuova ITN per ciascun risultato è stata analizzata anche per ottenere una singola stima per tutti i punti temporali. Oltre alla principale variabile esplicativa del trattamento, ogni modello includeva capanna, persona che dormiva, periodo di prova, indice di apertura della zanzariera trattata con insetticida (ITN) e giorno come effetti fissi per controllare la variabilità dovuta alle differenze nell'attrattività individuale di persone che dormivano e di capanne, alla stagionalità, allo stato della zanzariera e all'eccessiva dispersione. Le analisi di regressione hanno prodotto odds ratio (OR) aggiustati e i corrispondenti intervalli di confidenza al 95% per stimare l'effetto della zanzariera trattata con insetticida di nuova generazione rispetto alla zanzariera a base di soli piretroidi, Interceptor®, sugli esiti primari di mortalità e fecondità delle zanzare. I valori P dei modelli sono stati utilizzati anche per assegnare lettere compatte che indicano la significatività statistica al livello del 5% per tutti i confronti a coppie degli esiti primari e secondari. Tutte le analisi di regressione sono state eseguite con Stata versione 18.
La suscettibilità delle popolazioni del vettore Covese è stata interpretata sulla base della mortalità e della fecondità osservate in vitro e nei bioassay in bottiglia, secondo le raccomandazioni dell'Organizzazione Mondiale della Sanità. I risultati delle analisi chimiche hanno fornito il contenuto totale di influenza aviaria (IA) nei frammenti di zanzariere trattate con insetticida (ITN), che è stato utilizzato per calcolare il tasso di ritenzione dell'IA nelle zanzariere invecchiate sul campo rispetto alle zanzariere nuove in ogni momento di ogni anno. Tutti i dati sono stati registrati manualmente su moduli standardizzati e successivamente inseriti due volte in un database Microsoft Excel.
I comitati etici del Ministero della Salute del Benin (n. 6/30/MS/DC/DRFMT/CNERS/SA), della London School of Hygiene & Tropical Medicine (LSHTM) (n. 16237) e dell'Organizzazione Mondiale della Sanità (n. ERC.0003153) hanno approvato lo svolgimento di uno studio pilota in capanne con la partecipazione di volontari. Il consenso informato scritto è stato ottenuto da tutti i volontari prima della partecipazione allo studio. Tutti i volontari hanno ricevuto gratuitamente la chemioprofilassi per ridurre il rischio di malaria e un'infermiera era presente per tutta la durata dello studio per valutare qualsiasi volontario che sviluppasse sintomi di febbre o una reazione avversa al prodotto in esame.
I risultati completi delle capanne sperimentali, che riassumono il numero totale di zanzare vive/morte, affamate/nutrite di sangue e fertili/sterili per ciascun gruppo sperimentale, nonché le statistiche descrittive, sono presentati come materiale supplementare (Tabella S1).
In una capanna sperimentale a Kowa, in Benin, è stata soppressa l'alimentazione ematica delle zanzare Anopheles gambiae selvatiche resistenti ai piretroidi. I dati dei gruppi di controllo non trattati e delle nuove zanzariere sono stati aggregati tra le diverse prove per fornire una singola stima di efficacia. Mediante analisi di regressione logistica, le colonne con lettere comuni non presentavano differenze significative al livello del 5% (p > 0,05). Le barre di errore rappresentano gli intervalli di confidenza al 95%.
Mortalità delle zanzare Anopheles gambiae selvatiche resistenti ai piretroidi che entrano in una capanna sperimentale a Kowa, Benin. I dati dei controlli non trattati e delle nuove zanzariere sono stati aggregati tra le diverse prove per fornire una singola stima di efficacia. Mediante analisi di regressione logistica, le colonne con lettere comuni non presentavano differenze significative al livello del 5% (p > 0,05). Le barre di errore rappresentano gli intervalli di confidenza al 95%.
L'odds ratio descrive la differenza di mortalità tra le zanzariere di nuova generazione e quelle contenenti solo piretroidi. La linea tratteggiata rappresenta un odds ratio pari a 1, indicando l'assenza di differenza di mortalità. Un odds ratio > 1 indica una mortalità maggiore con le zanzariere di nuova generazione. I dati relativi alle zanzariere di nuova generazione sono stati aggregati tra i diversi studi per ottenere una singola stima di efficacia. Le barre di errore rappresentano gli intervalli di confidenza al 95%.
Sebbene Interceptor® abbia dimostrato la mortalità più bassa tra tutte le ITN testate, l'invecchiamento sul campo non ha influito negativamente sul suo impatto sulla mortalità dei vettori. Infatti, le nuove Interceptor® hanno determinato una mortalità del 12%, mentre le reti invecchiate sul campo hanno mostrato un leggero miglioramento a 12 mesi (17%, p=0,006) e 24 mesi (17%, p=0,004), prima di tornare a livelli simili alle nuove reti a 36 mesi (11%, p=0,05). Al contrario, i tassi di mortalità per la successiva generazione di reti trattate con insetticidi sono gradualmente diminuiti nel tempo dopo l'installazione. La riduzione è stata più pronunciata con Interceptor® G2, dove la mortalità è diminuita dal 58% con le nuove reti al 36% a 12 mesi (p< 0,001), 31% a 24 mesi (p< 0,001) e il 20% a 36 mesi (p< 0,001). Il nuovo PermaNet® 3.0 ha determinato una riduzione della mortalità al 37%, che è diminuita significativamente anche al 20% a 12 mesi (p< 0,001), 16% a 24 mesi (p< 0,001) e il 18% a 36 mesi (p< 0,001). Una tendenza simile è stata osservata con Royal Guard®, con la nuova rete che ha portato a una riduzione del 33% della mortalità, seguita da una riduzione significativa al 21% a 12 mesi (p< 0,001), 17% a 24 mesi (p< 0,001) e 15% a 36 mesi (p< 0,001).
Riduzione della fecondità delle zanzare Anopheles gambiae selvatiche resistenti ai piretroidi che entrano in una capanna sperimentale a Kwa, in Benin. I dati dei gruppi di controllo non trattati e delle nuove zanzariere sono stati aggregati tra le diverse prove per fornire una singola stima di efficacia. Le barre con lettere comuni non presentavano differenze significative al livello del 5% (p > 0,05) secondo l'analisi di regressione logistica. Le barre di errore rappresentano gli intervalli di confidenza al 95%.
Gli odds ratio descrivono la differenza di fertilità con le zanzariere di nuova generazione rispetto alle zanzariere contenenti solo piretroidi. La linea tratteggiata rappresenta un rapporto di 1, indicando nessuna differenza di fertilità. Odds ratio< 1 indica una maggiore riduzione della fertilità con le zanzariere di nuova generazione. I dati relativi alle zanzariere di nuova generazione sono stati aggregati tra i vari studi per produrre una singola stima di efficacia. Le barre di errore rappresentano gli intervalli di confidenza al 95%.
Data di pubblicazione: 17 febbraio 2025