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I fungicidi sono spesso utilizzati durante la fioritura degli alberi da frutto e possono rappresentare una minaccia per gli insetti impollinatori. Tuttavia, si sa poco su come gli impollinatori non api (ad esempio, le api solitarie, Osmia cornifrons) reagiscano ai fungicidi di contatto e sistemici comunemente usati sui meli durante la fioritura. Questa lacuna di conoscenza limita le decisioni normative che determinano le concentrazioni sicure e i tempi di irrorazione dei fungicidi. Abbiamo valutato gli effetti di due fungicidi di contatto (captano e mancozeb) e quattro fungicidi interstrato/fitosistemi (ciprociclina, miclobutanil, pirostrobina e trifloxistrobina). Gli effetti sono stati valutati sull'aumento di peso delle larve, sulla sopravvivenza, sul rapporto tra i sessi e sulla diversità batterica. La valutazione è stata condotta utilizzando un bioassay orale cronico in cui il polline è stato trattato con tre dosi basate sulla dose attualmente raccomandata per l'uso in campo (1X), mezza dose (0,5X) e una dose bassa (0,1X). Tutte le dosi di mancozeb e piritisolina hanno ridotto significativamente il peso corporeo e la sopravvivenza delle larve. Abbiamo quindi sequenziato il gene 16S per caratterizzare il batterioma larvale del mancozeb, il fungicida responsabile della mortalità più elevata. Abbiamo scoperto che la diversità e l'abbondanza batterica erano significativamente ridotte nelle larve nutrite con polline trattato con mancozeb. I nostri risultati di laboratorio indicano che l'irrorazione di alcuni di questi fungicidi durante la fioritura è particolarmente dannosa per la salute di O. cornifrons. Queste informazioni sono rilevanti per le future decisioni gestionali riguardanti l'uso sostenibile dei prodotti fitosanitari per gli alberi da frutto e costituiscono la base per i processi normativi volti a proteggere gli impollinatori.
L'ape muratrice solitaria Osmia cornifrons (Hymenoptera: Megachilidae) è stata introdotta negli Stati Uniti dal Giappone tra la fine degli anni '70 e l'inizio degli anni '80, e da allora questa specie ha svolto un ruolo importante come impollinatrice negli ecosistemi gestiti. Le popolazioni naturalizzate di quest'ape fanno parte di circa 50 specie di api selvatiche che integrano le api impollinatrici di mandorleti e meleti negli Stati Uniti2,3. Le api muratrici devono affrontare numerose sfide, tra cui la frammentazione dell'habitat, i patogeni e i pesticidi3,4. Tra gli insetticidi, i fungicidi riducono l'apporto energetico, la ricerca di cibo5 e la condizione fisica6,7. Sebbene recenti ricerche suggeriscano che la salute delle api muratrici sia direttamente influenzata da microrganismi commensali ed ectobatterici,8,9 poiché batteri e funghi possono influenzare la nutrizione e le risposte immunitarie, gli effetti dell'esposizione ai fungicidi sulla diversità microbica delle api muratrici sono solo all'inizio degli studi.
I fungicidi di vario tipo (per contatto e sistemici) vengono spruzzati nei frutteti prima e durante la fioritura per trattare malattie come la ticchiolatura del melo, il marciume amaro, il marciume bruno e l'oidio10,11. I fungicidi sono considerati innocui per gli impollinatori, quindi sono raccomandati ai giardinieri durante il periodo di fioritura; l'esposizione e l'ingestione di questi fungicidi da parte delle api sono relativamente note, in quanto fanno parte del processo di registrazione dei pesticidi da parte dell'Agenzia per la Protezione Ambientale degli Stati Uniti e di molte altre agenzie di regolamentazione nazionali12,13,14. Tuttavia, gli effetti dei fungicidi su organismi diversi dalle api sono meno noti perché non sono richiesti dagli accordi di autorizzazione all'immissione in commercio negli Stati Uniti15. Inoltre, in genere non esistono protocolli standardizzati per testare singole api16,17 e mantenere colonie che forniscano api per i test è difficile18. In Europa e negli Stati Uniti si stanno conducendo sempre più spesso prove su diverse specie di api allevate per studiare gli effetti dei pesticidi sulle api selvatiche e recentemente sono stati sviluppati protocolli standardizzati per O. cornifrons19.
Le api cornute sono monociti e vengono utilizzate commercialmente negli allevamenti di carpe come integratore o sostituto delle api da miele. Queste api emergono tra marzo e aprile, con i maschi precoci che emergono tre o quattro giorni prima delle femmine. Dopo l'accoppiamento, la femmina raccoglie attivamente polline e nettare per fornire una serie di celle di covata all'interno della cavità tubolare del nido (naturale o artificiale)1,20. Le uova vengono deposte sul polline all'interno delle celle; la femmina costruisce quindi una parete di argilla prima di preparare la cella successiva. Le larve di primo stadio sono racchiuse nel corion e si nutrono di fluidi embrionali. Dal secondo al quinto stadio (prepupa), le larve si nutrono di polline22. Una volta esaurita la scorta di polline, le larve formano bozzoli, si impupano ed emergono come adulti nella stessa camera di covata, di solito alla fine dell'estate20,23. Gli adulti emergono la primavera successiva. La sopravvivenza degli adulti è associata all'aumento netto di energia (aumento di peso) basato sull'assunzione di cibo. Pertanto, la qualità nutrizionale del polline, così come altri fattori quali le condizioni meteorologiche o l'esposizione ai pesticidi, sono determinanti per la sopravvivenza e la salute24.
Gli insetticidi e i fungicidi applicati prima della fioritura sono in grado di muoversi all'interno del sistema vascolare della pianta in misura variabile, da translaminare (ad esempio, in grado di spostarsi dalla superficie superiore delle foglie a quella inferiore, come alcuni fungicidi) 25 a effetti veramente sistemici. , che possono penetrare nella corona dalle radici, possono entrare nel nettare dei fiori di melo26, dove possono uccidere gli adulti di O. cornifrons27. Alcuni pesticidi si disperdono anche nel polline, influenzando lo sviluppo delle larve di mais e causandone la morte19. Altri studi hanno dimostrato che alcuni fungicidi possono alterare significativamente il comportamento di nidificazione della specie correlata O. lignaria28. Inoltre, studi di laboratorio e sul campo che simulano scenari di esposizione ai pesticidi (inclusi i fungicidi) hanno dimostrato che i pesticidi influenzano negativamente la fisiologia 22, la morfologia 29 e la sopravvivenza delle api da miele e di alcune api solitarie. Diversi spray fungicidi applicati direttamente sui fiori aperti durante la fioritura possono contaminare il polline raccolto dagli adulti per lo sviluppo larvale, i cui effetti restano da studiare30.
È sempre più riconosciuto che lo sviluppo larvale è influenzato dal polline e dalle comunità microbiche del sistema digerente. Il microbioma dell'ape mellifera influenza parametri come la massa corporea31, i cambiamenti metabolici22 e la suscettibilità agli agenti patogeni32. Studi precedenti hanno esaminato l'influenza dello stadio di sviluppo, dei nutrienti e dell'ambiente sul microbioma delle api solitarie. Questi studi hanno rivelato somiglianze nella struttura e nell'abbondanza dei microbiomi larvali e del polline33, così come dei generi batterici più comuni, Pseudomonas e Delftia, tra le specie di api solitarie. Tuttavia, sebbene i fungicidi siano stati associati a strategie per proteggere la salute delle api, gli effetti dei fungicidi sul microbiota larvale attraverso l'esposizione orale diretta rimangono inesplorati.
Questo studio ha testato gli effetti di dosi reali di sei fungicidi comunemente utilizzati e registrati per l'uso su alberi da frutto negli Stati Uniti, inclusi fungicidi di contatto e sistemici somministrati per via orale alle larve della falena del mais provenienti da alimenti contaminati. Abbiamo scoperto che i fungicidi di contatto e sistemici hanno ridotto l'aumento di peso corporeo delle api e aumentato la mortalità, con gli effetti più gravi associati a mancozeb e piritiopide. Abbiamo quindi confrontato la diversità microbica delle larve alimentate con una dieta a base di polline trattato con mancozeb con quelle alimentate con una dieta di controllo. Discutiamo i potenziali meccanismi alla base della mortalità e le implicazioni per i programmi di gestione integrata dei parassiti e degli impollinatori (IPPM)36.
Esemplari adulti di O. cornifrons svernanti in bozzoli sono stati ottenuti dal Fruit Research Center, Biglerville, PA, e conservati a −3 a 2 °C (±0,3 °C). Prima dell'esperimento (600 bozzoli in totale). Nel maggio 2022, 100 bozzoli di O. cornifrons sono stati trasferiti quotidianamente in bicchieri di plastica (50 bozzoli per bicchiere, DI 5 cm × 15 cm di lunghezza) e sono state poste delle salviette all'interno dei bicchieri per favorire l'apertura e fornire un substrato masticabile, riducendo lo stress sulle api pietrose37. Posizionare due bicchieri di plastica contenenti bozzoli in una gabbia per insetti (30 × 30 × 30 cm, BugDorm MegaView Science Co. Ltd., Taiwan) con alimentatori da 10 ml contenenti una soluzione di saccarosio al 50% e conservare per quattro giorni per garantire la chiusura e l'accoppiamento. 23 °C, umidità relativa 60%, fotoperiodo 10 l (bassa intensità): 14 giorni. Ogni mattina, per sei giorni, sono stati rilasciati 100 esemplari, tra femmine e maschi, in due nidi artificiali durante il periodo di massima fioritura dei meli (nido trappola: larghezza 33,66 × altezza 30,48 × lunghezza 46,99 cm; Figura supplementare 1). Collocate presso l'Arboreto Statale della Pennsylvania, vicino a ciliegi (Prunus cerasus 'Eubank' Sweet Cherry Pie™), peschi (Prunus persica 'Contender', Prunus persica 'PF 27A' Flamin Fury®), peri (Pyrus perifolia 'Olympic', Pyrus perifolia 'Shinko', Pyrus perifolia 'Shinseiki'), meli coronaria (Malus coronaria) e numerose varietà di meli (Malus coronaria, Malus), meli domestici 'Co-op 30' Enterprise™, meli Malus 'Co-Op 31' Winecrisp™, begonie 'Freedom', Begonia 'Golden Delicious', Begonia 'Nova Spy'). Ogni casetta per uccelli in plastica blu si adatta sopra due scatole di legno. Ogni nido conteneva 800 tubi di carta kraft vuoti (a spirale aperta, 0,8 cm ID × 15 cm L) (Jonesville Paper Tube Co., Michigan) inseriti in tubi di cellophane opaco (0,7 OD vedi I tappi di plastica (tappi T-1X) forniscono siti di nidificazione.
Entrambe le cassette nido erano rivolte a est ed erano coperte con una rete metallica verde per giardini (modello Everbilt n. 889250EB12, dimensioni delle aperture 5 × 5 cm, 0,95 m × 100 m) per impedire l'accesso a roditori e uccelli e posizionate sulla superficie del terreno accanto alle cassette nido. Cassetta nido (Figura supplementare 1a). Le uova di piralide del mais venivano raccolte quotidianamente prelevando 30 tubi dai nidi e trasportandoli in laboratorio. Con delle forbici, si praticava un taglio all'estremità del tubo, quindi si smontava il tubo a spirale per esporre le celle di covata. Le singole uova e il loro polline venivano rimossi utilizzando una spatola curva (kit di strumenti Microslide, BioQuip Products Inc., California). Le uova venivano incubate su carta da filtro umida e poste in una piastra di Petri per 2 ore prima di essere utilizzate nei nostri esperimenti (Figura supplementare 1b-d).
In laboratorio, abbiamo valutato la tossicità orale di sei fungicidi applicati prima e durante la fioritura del melo a tre concentrazioni (0,1X, 0,5X e 1X, dove 1X è il valore applicato per 100 galloni d'acqua/acro. Dose elevata in campo = concentrazione in campo). , Tabella 1). Ogni concentrazione è stata ripetuta 16 volte (n = 16). Due fungicidi di contatto (Tabella S1: mancozeb 2696,14 ppm e captan 2875,88 ppm) e quattro fungicidi sistemici (Tabella S1: pyrithiostrobin 250,14 ppm; trifloxystrobin 110,06 ppm; myclobutanil azole 75,12 ppm; cyprodinil 280,845 ppm) hanno mostrato tossicità per frutta, verdura e colture ornamentali. Abbiamo omogeneizzato il polline utilizzando un macinino, trasferito 0,20 g in un pozzetto (piastra Falcon a 24 pozzetti) e aggiunto e mescolato 1 μL di soluzione fungicida per formare un polline piramidale con pozzetti profondi 1 mm in cui sono state collocate le uova. Posizionamento effettuato con una mini spatola (Figura supplementare 1c,d). Le piastre Falcon sono state conservate a temperatura ambiente (25 °C) e con un'umidità relativa del 70%. Abbiamo confrontato le larve con quelle di controllo alimentate con una dieta omogenea a base di polline trattato con acqua pura. Abbiamo registrato la mortalità e misurato il peso delle larve a giorni alterni fino al raggiungimento dello stadio di prepupa, utilizzando una bilancia analitica (Fisher Scientific, precisione = 0,0001 g). Infine, il rapporto tra i sessi è stato valutato aprendo il bozzolo dopo 2,5 mesi.
Il DNA è stato estratto da larve intere di O. cornifrons (n = 3 per condizione di trattamento, polline trattato con mancozeb e polline non trattato) e abbiamo eseguito analisi di diversità microbica su questi campioni, soprattutto perché nel mancozeb la mortalità più elevata è stata osservata nelle larve che ricevevano MnZn. Il DNA è stato amplificato, purificato utilizzando il kit DNAZymoBIOMICS®-96 MagBead DNA (Zymo Research, Irvine, CA) e sequenziato (600 cicli) su un Illumina® MiSeq™ utilizzando il kit v3. Il sequenziamento mirato dei geni dell'RNA ribosomiale 16S batterico è stato eseguito utilizzando il kit Quick-16S™ NGS Library Prep (Zymo Research, Irvine, CA) utilizzando primer che prendono di mira la regione V3-V4 del gene 16S rRNA. Inoltre, è stato eseguito il sequenziamento del gene 18S utilizzando l'inclusione del 10% di PhiX e l'amplificazione è stata effettuata utilizzando la coppia di primer 18S001 e NS4.
Importazione ed elaborazione delle letture accoppiate39 utilizzando la pipeline QIIME2 (v2022.11.1). Queste letture sono state tagliate e unite, e le sequenze chimeriche sono state rimosse utilizzando il plugin DADA2 in QIIME2 (qiime dada2 noise pairing)40. Le assegnazioni di classe 16S e 18S sono state eseguite utilizzando il plugin di classificazione degli oggetti Classify-sklearn e l'artefatto pre-addestrato silva-138-99-nb-classifier.
Tutti i dati sperimentali sono stati controllati per la normalità (Shapiro-Wilk) e l'omogeneità delle varianze (test di Levene). Poiché il set di dati non soddisfaceva i presupposti dell'analisi parametrica e la trasformazione non è riuscita a standardizzare i residui, abbiamo eseguito un'ANOVA non parametrica a due vie (Kruskal-Wallis) con due fattori [tempo (punti temporali di 2, 5 e 8 giorni in tre fasi) e fungicida] per valutare l'effetto del trattamento sul peso fresco delle larve, quindi sono stati eseguiti confronti a coppie non parametrici post hoc utilizzando il test di Wilcoxon. Abbiamo utilizzato un modello lineare generalizzato (GLM) con una distribuzione di Poisson per confrontare gli effetti dei fungicidi sulla sopravvivenza a tre concentrazioni di fungicida41,42. Per l'analisi dell'abbondanza differenziale, il numero di varianti di sequenza dell'amplicone (ASV) è stato aggregato a livello di genere. I confronti dell'abbondanza differenziale tra i gruppi utilizzando l'abbondanza relativa di 16S (a livello di genere) e 18S sono stati eseguiti utilizzando un modello additivo generalizzato per posizione, scala e forma (GAMLSS) con distribuzioni familiari beta zero-inflated (BEZI), che sono state modellate su una macro in Microbiome R43 (v1.1). 1). Rimuovere le specie mitocondriali e cloroplastiche prima dell'analisi differenziale. A causa dei diversi livelli tassonomici di 18S, solo il livello più basso di ciascun taxon è stato utilizzato per le analisi differenziali. Tutte le analisi statistiche sono state eseguite utilizzando R (v. 3.4.3, progetto CRAN) (Team 2013).
L'esposizione a mancozeb, piritiostrobina e trifloxistrobina ha ridotto significativamente l'aumento di peso corporeo in O. cornifrons (Fig. 1). Questi effetti sono stati osservati in modo coerente per tutte e tre le dosi valutate (Fig. 1a-c). Ciclostrobina e miclobutanil non hanno ridotto significativamente il peso delle larve.
Peso fresco medio delle larve di perforatore del fusto misurato in tre momenti diversi sotto quattro trattamenti dietetici (alimentazione omogenea a base di polline + fungicida: controllo, dosi 0,1X, 0,5X e 1X). (a) Bassa dose (0,1X): primo momento (giorno 1): χ2: 30,99, DF = 6; P < 0,0001, secondo momento (giorno 5): 22,83, DF = 0,0009; terzo momento (giorno 8): χ2: 28,39, DF = 6; (b) mezza dose (0,5X): primo momento (giorno 1): χ2: 35,67, DF = 6; P < 0,0001, secondo momento (giorno uno): χ2: 15,98, DF = 6; P = 0,0090; terzo punto temporale (giorno 8) χ2: 16,47, DF = 6; (c) Sito o dose completa (1X): primo punto temporale (giorno 1) χ2: 20,64, P = 6; P = 0,0326, secondo punto temporale (giorno 5): χ2: 22,83, DF = 6; P = 0,0009; terzo punto temporale (giorno 8): χ2: 28,39, DF = 6; analisi non parametrica della varianza. Le barre rappresentano la media ± SE dei confronti a coppie (α = 0,05) (n = 16) *P ≤ 0,05, **P ≤ 0,001, ***P ≤ 0,0001.
Alla dose più bassa (0,1X), il peso corporeo delle larve è stato ridotto del 60% con trifloxistrobina, del 49% con mancozeb, del 48% con miclobutanil e del 46% con piritistrobina (Fig. 1a). Quando esposte a metà della dose di campo (0,5X), il peso corporeo delle larve trattate con mancozeb è stato ridotto dell'86%, con piritistrobina del 52% e con trifloxistrobina del 50% (Fig. 1b). Una dose di campo completa (1X) di mancozeb ha ridotto il peso delle larve dell'82%, con piritistrobina del 70% e con trifloxistrobina, miclobutanil e sangard di circa il 30% (Fig. 1c).
La mortalità è risultata più elevata tra le larve alimentate con polline trattato con mancozeb, seguita da quelle alimentate con piritiostrobina e trifloxistrobina. La mortalità è aumentata con l'aumentare delle dosi di mancozeb e piritisolina (Fig. 2; Tabella 2). Tuttavia, la mortalità della piralide del mais è aumentata solo leggermente con l'aumentare delle concentrazioni di trifloxistrobina; il ciprodinil e il captano non hanno aumentato significativamente la mortalità rispetto ai trattamenti di controllo.
La mortalità delle larve di mosca perforatrice è stata confrontata dopo l'ingestione di polline trattato individualmente con sei diversi fungicidi. Mancozeb e pentopiramide sono risultati più sensibili all'esposizione orale alle larve di mosca del mais (GLM: χ = 29,45, DF = 20, P = 0,0059) (linea, pendenza = 0,29, P < 0,001; pendenza = 0,24, P <0,00)).
In media, considerando tutti i trattamenti, il 39,05% dei pazienti era di sesso femminile e il 60,95% di sesso maschile. Tra i trattamenti di controllo, la proporzione di donne era del 40% sia negli studi a basso dosaggio (0,1X) che a mezza dose (0,5X), e del 30% negli studi a dose di campo (1X). Alla dose di 0,1X, tra le larve nutrite con polline trattate con mancozeb e miclobutanil, il 33,33% degli adulti era di sesso femminile, il 22% degli adulti era di sesso femminile, il 44% delle larve adulte era di sesso femminile, il 44% delle larve adulte era di sesso femminile. Il 41% delle larve adulte era di sesso femminile e i controlli erano al 31% (Fig. 3a). A una dose pari a 0,5 volte la dose, il 33% dei vermi adulti nel gruppo mancozeb e piritiostrobina erano femmine, il 36% nel gruppo trifloxistrobina, il 41% nel gruppo miclobutanil e il 46% nel gruppo ciprostrobina. Questa cifra era del 53% nel gruppo captano e del 38% nel gruppo di controllo (Fig. 3b). A una dose pari a 1X, il 30% del gruppo mancozeb erano femmine, il 36% del gruppo piritiostrobina, il 44% del gruppo trifloxistrobina, il 38% del gruppo miclobutanil, il 50% del gruppo di controllo erano femmine – 38,5% (Fig. 3c).
Percentuale di larve di perforatori femmine e maschi dopo l'esposizione al fungicida. (a) Dose bassa (0,1X). (b) Mezza dose (0,5X). (c) Dose da campo o dose piena (1X).
L'analisi della sequenza 16S ha mostrato che il gruppo batterico differiva tra le larve alimentate con polline trattato con mancozeb e le larve alimentate con polline non trattato (Fig. 4a). L'indice microbico delle larve non trattate alimentate con polline era più alto di quello delle larve alimentate con polline trattato con mancozeb (Fig. 4b). Sebbene la differenza osservata nella ricchezza tra i gruppi non fosse statisticamente significativa, era significativamente inferiore a quella osservata per le larve alimentate con polline non trattato (Fig. 4c). L'abbondanza relativa ha mostrato che il microbiota delle larve alimentate con polline di controllo era più diversificato di quello delle larve alimentate con polline trattato con mancozeb (Fig. 5a). L'analisi descrittiva ha rivelato la presenza di 28 generi nei campioni di controllo e trattati con mancozeb (Fig. 5b). c L'analisi mediante sequenziamento 18S non ha rivelato differenze significative (Figura supplementare 2).
I profili SAV basati sulle sequenze 16S sono stati confrontati con la ricchezza di Shannon e la ricchezza osservata a livello di phylum. (a) Analisi delle coordinate principali (PCoA) basata sulla struttura complessiva della comunità microbica in larve alimentate con polline non trattato o di controllo (blu) e alimentate con mancozeb (arancione). Ogni punto dati rappresenta un campione separato. La PCoA è stata calcolata utilizzando la distanza di Bray-Curtis della distribuzione t multivariata. Gli ovali rappresentano il livello di confidenza dell'80%. (b) Boxplot, dati grezzi della ricchezza di Shannon (punti) e c. Ricchezza osservabile. I boxplot mostrano le caselle per la linea mediana, l'intervallo interquartile (IQR) e 1,5 × IQR (n = 3).
Composizione delle comunità microbiche delle larve alimentate con polline trattato e non trattato con mancozeb. (a) Abbondanza relativa dei generi microbici rilevati nelle larve. (b) Mappa di calore delle comunità microbiche identificate. Delftia (odds ratio (OR) = 0,67, P = 0,0030) e Pseudomonas (OR = 0,3, P = 0,0074), Microbacterium (OR = 0,75, P = 0,0617) (OR = 1,5, P = 0,0060); Le righe della mappa di calore sono raggruppate utilizzando la distanza di correlazione e la connettività media.
I nostri risultati mostrano che l'esposizione orale a fungicidi di contatto (mancozeb) e sistemici (pirostrobina e trifloxistrobina), ampiamente applicati durante la fioritura, ha ridotto significativamente l'aumento di peso e aumentato la mortalità delle larve di mais. Inoltre, il mancozeb ha ridotto significativamente la diversità e la ricchezza del microbioma durante lo stadio prepuziale. Il miclobutanil, un altro fungicida sistemico, ha ridotto significativamente l'aumento di peso corporeo delle larve a tutte e tre le dosi. Questo effetto è stato evidente al secondo (giorno 5) e al terzo (giorno 8) punto temporale. Al contrario, il ciprodinil e il captano non hanno ridotto significativamente l'aumento di peso o la sopravvivenza rispetto al gruppo di controllo. Per quanto ne sappiamo, questo lavoro è il primo a determinare gli effetti delle dosi di campo di diversi fungicidi utilizzati per proteggere le colture di mais attraverso l'esposizione diretta al polline.
Tutti i trattamenti fungicidi hanno ridotto significativamente l'aumento di peso corporeo rispetto ai trattamenti di controllo. Il mancozeb ha avuto l'effetto maggiore sull'aumento di peso corporeo delle larve, con una riduzione media del 51%, seguito dal piritiostrobin. Tuttavia, altri studi non hanno riportato effetti avversi delle dosi di campo di fungicidi sugli stadi larvali44. Sebbene sia stato dimostrato che i biocidi ditiocarbammati abbiano una bassa tossicità acuta45, gli etilene bisditiocarbammati (EBDCS) come il mancozeb possono degradarsi in urea etilene solfuro. Dati i suoi effetti mutageni in altri animali, questo prodotto di degradazione potrebbe essere responsabile degli effetti osservati46,47. Studi precedenti hanno dimostrato che la formazione di etilene tiourea è influenzata da fattori quali temperature elevate48, livelli di umidità49 e durata della conservazione del prodotto50. Condizioni di conservazione adeguate per i biocidi possono mitigare questi effetti collaterali. Inoltre, l'Autorità europea per la sicurezza alimentare ha espresso preoccupazione per la tossicità del piritiopide, che si è dimostrato cancerogeno per l'apparato digerente di altri animali51.
La somministrazione orale di mancozeb, piritiostrobina e trifloxistrobina aumenta la mortalità delle larve di piralide del mais. Al contrario, miclobutanil, ciprociclina e captano non hanno avuto alcun effetto sulla mortalità. Questi risultati differiscono da quelli di Ladurner et al.52, che hanno dimostrato che il captano riduceva significativamente la sopravvivenza degli adulti di O. lignaria e Apis mellifera L. (Hymenoptera, Apisidae). Inoltre, è stato riscontrato che fungicidi come il captano e il boscalid causano mortalità larvale52,53,54 o alterano il comportamento alimentare55. Questi cambiamenti, a loro volta, possono influenzare la qualità nutrizionale del polline e, in definitiva, l'apporto energetico dello stadio larvale. La mortalità osservata nel gruppo di controllo era coerente con altri studi56,57.
Il rapporto sessuale a favore dei maschi osservato nel nostro lavoro può essere spiegato da fattori quali un accoppiamento insufficiente e condizioni meteorologiche avverse durante la fioritura, come precedentemente suggerito per O. cornuta da Vicens e Bosch. Sebbene femmine e maschi nel nostro studio avessero quattro giorni per accoppiarsi (un periodo generalmente considerato sufficiente per un accoppiamento di successo), abbiamo deliberatamente ridotto l'intensità luminosa per minimizzare lo stress. Tuttavia, questa modifica potrebbe inavvertitamente interferire con il processo di accoppiamento61. Inoltre, le api sono esposte a diversi giorni di condizioni meteorologiche avverse, tra cui pioggia e basse temperature (<5°C), che possono anche influire negativamente sul successo dell'accoppiamento4,23.
Sebbene il nostro studio si sia concentrato sull'intero microbioma larvale, i nostri risultati forniscono informazioni sulle potenziali relazioni tra le comunità batteriche che potrebbero essere cruciali per la nutrizione delle api e l'esposizione ai fungicidi. Ad esempio, le larve alimentate con polline trattato con mancozeb presentavano una struttura e un'abbondanza della comunità microbica significativamente ridotte rispetto alle larve alimentate con polline non trattato. Nelle larve che consumavano polline non trattato, i gruppi batterici Proteobacteria e Actinobacteria erano dominanti ed erano prevalentemente aerobici o facoltativamente aerobici. I batteri di Delft, solitamente associati alle specie di api solitarie, sono noti per la loro attività antibiotica, il che indica un potenziale ruolo protettivo contro i patogeni. Un'altra specie batterica, Pseudomonas, era abbondante nelle larve alimentate con polline non trattato, ma era significativamente ridotta nelle larve trattate con mancozeb. I nostri risultati supportano studi precedenti che identificano Pseudomonas come uno dei generi più abbondanti in O. bicornis35 e in altre vespe solitarie34. Sebbene non siano state studiate prove sperimentali sul ruolo di Pseudomonas nella salute di O. cornifrons, è stato dimostrato che questo batterio promuove la sintesi di tossine protettive nel coleottero Paederus fuscipes e favorisce il metabolismo dell'arginina in vitro 35, 65. Queste osservazioni suggeriscono un potenziale ruolo nella difesa virale e batterica durante lo sviluppo delle larve di O. cornifrons. Microbacterium è un altro genere identificato nel nostro studio che risulta essere presente in gran numero nelle larve di mosca soldato nera in condizioni di digiuno66. Nelle larve di O. cornifrons, i microbatteri possono contribuire all'equilibrio e alla resilienza del microbiota intestinale in condizioni di stress. Inoltre, Rhodococcus è presente nelle larve di O. cornifrons ed è noto per le sue capacità di detossificazione67. Questo genere si trova anche nell'intestino di A. florea, ma in quantità molto ridotte68. I nostri risultati dimostrano la presenza di molteplici variazioni genetiche in numerosi taxa microbici che possono alterare i processi metabolici nelle larve. Tuttavia, è necessaria una migliore comprensione della diversità funzionale di O. cornifrons.
In sintesi, i risultati indicano che mancozeb, piritiostrobina e trifloxistrobina hanno ridotto l'aumento di peso corporeo e aumentato la mortalità delle larve della piralide del mais. Sebbene vi sia una crescente preoccupazione per gli effetti dei fungicidi sugli impollinatori, è necessario comprendere meglio gli effetti dei metaboliti residui di questi composti. Questi risultati possono essere incorporati nelle raccomandazioni per i programmi di gestione integrata degli impollinatori che aiutano gli agricoltori a evitare l'uso di determinati fungicidi prima e durante la fioritura degli alberi da frutto, selezionando i fungicidi e variando i tempi di applicazione, o incoraggiando l'uso di alternative meno dannose 36. Queste informazioni sono importanti per lo sviluppo di raccomandazioni sull'uso dei pesticidi, come l'adeguamento dei programmi di irrorazione esistenti e la modifica dei tempi di irrorazione nella selezione dei fungicidi o la promozione dell'uso di alternative meno pericolose. Sono necessarie ulteriori ricerche sugli effetti avversi dei fungicidi sul rapporto tra i sessi, sul comportamento alimentare, sul microbioma intestinale e sui meccanismi molecolari alla base della perdita di peso e della mortalità della piralide del mais.
I dati sorgente 1, 2 e 3 delle Figure 1 e 2 sono stati depositati nel repository di dati figshare DOI: https://doi.org/10.6084/m9.figshare.24996245 e https://doi.org/10.6084/m9.figshare.24996233. Le sequenze analizzate nel presente studio (Figure 4, 5) sono disponibili nel repository NCBI SRA con il numero di accesso PRJNA1023565.
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Data di pubblicazione: 14-05-2024