Materiale vegetale e patogeno
Una popolazione di mappatura dell'associazione del sorgo, nota come popolazione di conversione del sorgo (SCP), è stata fornita dal Dr. Pat Brown dell'Università dell'Illinois (ora presso la UC Davis). È stata descritta in precedenza ed è una collezione di diverse linee convertite all'insensibilità al fotoperiodo e a una statura più piccola per facilitare la crescita e lo sviluppo delle piante negli ambienti statunitensi. 510 linee di questa popolazione sono state utilizzate in questo studio, sebbene, a causa di problemi di germinazione e altri problemi di controllo qualità, non tutte le linee siano state utilizzate nell'analisi di tutti e tre i caratteri. In definitiva, i dati di 345 linee sono stati utilizzati per l'analisi della risposta alla chitina, 472 linee per la risposta al gene flg22 e 456 per la resistenza alla TLS.B. cookeiIl ceppo LSLP18 è stato ottenuto dal Dr. Burt Bluhm dell'Università dell'Arkansas.
Misurazione della risposta MAMP
In questo studio sono stati utilizzati due diversi MAMP: flg22 (Genscript catalogo n. RP19986) e chitina. Le piante di sorgo sono state coltivate in serra utilizzando inserti posizionati su vassoi riempiti di terriccio (33% Sunshine Redi-Earth Pro Growing Mix). Le piante sono state irrigate il giorno prima della raccolta dei campioni per evitare un eccesso di umidità fogliare il giorno della raccolta.
Le linee sono state randomizzate e, per ragioni logistiche, piantate in lotti di 60 linee. Per ogni linea, sono stati piantati tre "vasi" con due semi per linea. I lotti successivi sono stati piantati non appena il lotto precedente era stato elaborato, fino a quando l'intera popolazione non è stata valutata. Sono state condotte due serie sperimentali per entrambi i MAMP, con i genotipi ri-randomizzati in ciascuna delle due serie.
I test ROS sono stati eseguiti come precedentemente descritto. In breve, per ogni linea, sono stati piantati sei semi in 3 vasi diversi. Dalle piantine risultanti, ne sono state selezionate tre in base all'uniformità. Le piantine che apparivano insolite o che erano significativamente più alte o più basse della maggioranza non sono state utilizzate. Quattro dischi fogliari di 3 mm di diametro sono stati escissi dalla parte più larga della quarta foglia di tre diverse piante di sorgo di 15 giorni. Un disco per foglia da due piante e due dischi da una pianta, con il secondo disco che è diventato il controllo dell'acqua (vedi sotto). I dischi sono stati fatti galleggiare singolarmente su 50 µl di H2O in una piastra nera a 96 pozzetti, sigillata con un sigillo di alluminio per evitare l'esposizione alla luce e mantenuta a temperatura ambiente per tutta la notte. La mattina seguente è stata preparata una soluzione di reazione utilizzando 2 mg/ml di sonda chemiluminescente L-012 (Wako, codice catalogo n. 120-04891), 2 mg/ml di perossidasi di rafano (Tipo VI-A, Sigma-Aldrich, codice catalogo n. P6782) e 100 mg/ml di chitina o 2 μM di Flg22. 50 µl di questa soluzione di reazione sono stati aggiunti a tre dei quattro pozzetti. Il quarto pozzetto fungeva da controllo negativo, al quale è stata aggiunta la soluzione di reazione senza il MAMP. In ogni piastra sono stati inclusi anche quattro pozzetti vuoti contenenti solo acqua.
Dopo l'aggiunta della soluzione di reazione, la luminescenza è stata misurata ogni 2 minuti per 1 ora utilizzando il lettore di micropiastre a rilevamento multiplo SynergyTM 2 (BioTek). Il lettore di micropiastre effettua misurazioni di luminescenza ogni 2 minuti durante quest'ora. La somma di tutte le 31 letture è stata calcolata per ottenere il valore per ciascun pozzetto. Il valore stimato per la risposta MAMP per ciascun genotipo è stato calcolato come (valore medio di luminescenza dei tre pozzetti sperimentali - valore del pozzetto di controllo) - meno il valore medio del pozzetto di controllo. I valori del pozzetto di controllo erano costantemente prossimi a zero.
Dischi fogliari diNicotiana benthamianaIn ogni piastra a 96 pozzetti, a scopo di controllo qualità, sono state incluse anche una linea di sorgo ad alta risposta (SC0003) e una linea di sorgo a bassa risposta (PI 6069).
B. cookeipreparazione dell'inoculo e inoculazione
B. cookeiL'inoculo è stato preparato come descritto in precedenza. In breve, i chicchi di sorgo sono stati immersi in acqua per tre giorni, risciacquati, raccolti in beute coniche da 1 litro e sterilizzati in autoclave per un'ora a 15 psi e 121 °C. I chicchi sono stati quindi inoculati con circa 5 ml di micelio macerato da una coltura fresca diB. cookeiGli isolati LSLP18 sono stati lasciati a temperatura ambiente per 2 settimane, agitando le fiasche ogni 3 giorni. Dopo 2 settimane, i chicchi di sorgo infestati dal fungo sono stati essiccati all'aria e poi conservati a 4 °C fino all'inoculazione in campo. Lo stesso inoculo è stato utilizzato per l'intera prova e preparato fresco ogni anno. Per l'inoculazione, 6-10 chicchi infestati sono stati posti nella verticillo di piante di sorgo di 4-5 settimane. Le spore prodotte da questi funghi hanno avviato l'infezione nelle giovani piante di sorgo entro una settimana.
Preparazione dei semi
Prima della semina in campo, i semi di sorgo sono stati trattati con una miscela di fungicida, insetticida e fitoprotettivo contenente circa l'1% di fungicida Spirato 480 FS, il 4% di fungicida Sebring 480 FS e il 3% di fitoprotettivo Sorpro 940 ES. Successivamente, i semi sono stati lasciati essiccare all'aria per 3 giorni, in modo da formare un sottile strato di questa miscela attorno alla superficie. Il fitoprotettivo ha permesso l'utilizzo dell'erbicida Dual Magnum come trattamento pre-emergenza.
Valutazione della resistenza alla maculatura fogliare bersaglio
Il progetto SCP è stato realizzato presso la Central Crops Research Station di Clayton, NC, il 14-15 giugno 2017 e il 20 giugno 2018, secondo un disegno sperimentale a blocchi randomizzati completi con due repliche in ciascun caso. Gli esperimenti sono stati impiantati in file singole di 1,8 m con una larghezza di 0,9 m, utilizzando 10 semi per parcella. Due file di bordo sono state piantate attorno al perimetro di ciascun esperimento per prevenire effetti di bordo. Gli esperimenti sono stati inoculati il 20 luglio 2017 e il 20 luglio 2018, momento in cui le piante di sorgo si trovavano allo stadio di crescita 3. Le valutazioni sono state effettuate su una scala da uno a nove, dove le piante che non mostravano segni di malattia ricevevano un punteggio di nove e le piante completamente morte un punteggio di uno. Sono state effettuate due valutazioni nel 2017 e quattro nel 2018, a partire da due settimane dopo l'inoculazione di ciascun anno. L'sAUDPC (area standardizzata sotto la curva di progressione della malattia) è stata calcolata come descritto in precedenza.
Data di pubblicazione: 01-04-2021