Materiali vegetali e patogeni
Una popolazione di mappatura dell'associazione del sorgo, nota come popolazione di conversione del sorgo (SCP), è stata fornita dalla Dott.ssa Pat Brown dell'Università dell'Illinois (ora presso la UC Davis). È stata descritta in precedenza ed è un insieme di diverse linee convertite in insensibilità al fotoperiodo e con statura inferiore per facilitare la crescita e lo sviluppo delle piante negli ambienti statunitensi. 510 linee di questa popolazione sono state utilizzate in questo studio, sebbene a causa di una germinazione insufficiente e di altri problemi di controllo qualità, non tutte le linee siano state utilizzate nell'analisi di tutti e tre i caratteri. In definitiva, i dati di 345 linee sono stati utilizzati per l'analisi della risposta alla chitina, 472 linee per la risposta a flg22 e 456 per la resistenza a TLS.B. cookieil ceppo LSLP18 è stato ottenuto dal Dott. Burt Bluhm presso l'Università dell'Arkansas.
Misurazione della risposta MAMP
In questo studio sono stati utilizzati due diversi MAMP flg22 (catalogo Genscript n. RP19986) e chitina. Le piante di sorgo sono state coltivate in inserti disposti su piani riempiti con terriccio (33% Sunshine Redi-Earth Pro Growing Mix) in serra. Le piante sono state annaffiate il giorno prima della raccolta del campione per evitare un'eccessiva umidità fogliare il giorno della raccolta.
Le linee sono state randomizzate e, per motivi logistici, piantate in lotti di 60 linee. Per ogni linea, sono stati piantati tre "vasi" con due semi per linea. I lotti successivi sono stati piantati non appena il lotto precedente è stato processato, fino a quando l'intera popolazione non è stata valutata. Sono state condotte due serie sperimentali per entrambi i MAMP, con genotipi ri-randomizzati in ciascuna delle due serie.
I test ROS sono stati condotti come descritto in precedenza. In breve, per ogni linea, sei semi sono stati piantati in 3 vasi diversi. Dalle piantine risultanti, tre sono state selezionate in base all'uniformità. Le piantine dall'aspetto insolito o significativamente più alte o più basse della maggior parte non sono state utilizzate. Quattro dischi di foglie di 3 mm di diametro sono stati escissi dalla parte più larga della quarta foglia di tre diverse piante di sorgo di 15 giorni. Un disco per foglia da due piante e due dischi da una pianta, con il secondo disco come controllo idrico (vedi sotto). I dischi sono stati flottati individualmente su 50 µl di H2O in una piastra nera a 96 pozzetti, sigillati con un sigillo di alluminio per evitare l'esposizione alla luce e conservati a temperatura ambiente per una notte. Il mattino successivo è stata preparata una soluzione di reazione utilizzando la sonda chemiluminescente L-012 (Wako, n. catalogo 120-04891) da 2 mg/ml, perossidasi di rafano (tipo VI-A, Sigma-Aldrich, n. catalogo P6782) da 2 mg/ml e chitina (100 mg/ml) o 2 μM di Flg22. 50 µl di questa soluzione di reazione sono stati aggiunti a tre dei quattro pozzetti. Il quarto pozzetto era un controllo simulato, a cui è stata aggiunta la soluzione di reazione senza il MAMP. In ogni piastra sono stati inclusi anche quattro pozzetti vuoti contenenti solo acqua.
Dopo l'aggiunta della soluzione di reazione, la luminescenza è stata misurata utilizzando il lettore di micropiastre multi-rilevamento SynergyTM 2 (BioTek) ogni 2 minuti per 1 ora. Il lettore di piastre effettua misurazioni della luminescenza ogni 2 minuti durante questa ora. La somma di tutte le 31 letture è stata calcolata per ottenere il valore per ciascun pozzetto. Il valore stimato per la risposta MAMP per ciascun genotipo è stato calcolato come (valore medio di luminescenza dei tre pozzetti sperimentali – il valore del pozzetto simulato) - meno il valore medio del pozzetto bianco. I valori dei pozzetti bianchi erano costantemente prossimi allo zero.
Dischi fogliari diNicotiana benthamiana, una linea di sorgo ad alta reattività (SC0003) e una linea di sorgo a bassa reattività (PI 6069) sono state incluse come controlli in ogni piastra da 96 pozzetti per scopi di controllo qualità.
B. cookiepreparazione dell'inoculo e inoculazione
B. cookieL'inoculo è stato preparato come descritto in precedenza. In breve, i granuli di sorgo sono stati immersi in acqua per tre giorni, risciacquati, trasferiti in beute coniche da 1 litro e autoclavati per un'ora a 15 psi e 121 °C. I granuli sono stati quindi inoculati con circa 5 ml di micelio macerato da una coltura fresca diB. cookieGli isolati di LSLP18 sono stati lasciati per 2 settimane a temperatura ambiente, agitando le beute ogni 3 giorni. Dopo 2 settimane, i granuli di sorgo infestati dal fungo sono stati essiccati all'aria e poi conservati a 4 °C fino all'inoculazione in campo. Lo stesso inoculo è stato utilizzato per l'intera prova e preparato fresco ogni anno. Per l'inoculazione, 6-10 granuli infestati sono stati inseriti nel verticillo di piante di sorgo di 4-5 settimane di età. Le spore prodotte da questi funghi hanno avviato l'infezione nelle giovani piante di sorgo entro una settimana.
Preparazione dei semi
Prima della semina in campo, i semi di sorgo sono stati trattati con una miscela di fungicida, insetticida e anticrittogamico contenente circa l'1% di fungicida Spirato 480 FS, il 4% di fungicida Sebring 480 FS e il 3% di anticrittogamico Sorpro 940 ES. I semi sono stati quindi essiccati all'aria per 3 giorni, formando un sottile strato di questa miscela attorno ai semi. L'anticrittogamico ha permesso l'utilizzo dell'erbicida Dual Magnum come trattamento pre-emergenza.
Valutazione della resistenza alla macchia fogliare target
L'SCP è stato piantato presso la Central Crops Research Station di Clayton, NC, il 14-15 giugno 2017 e il 20 giugno 2018 in un disegno a blocchi randomizzati completi con due repliche sperimentali in ciascun caso. Gli esperimenti sono stati piantati in file singole di 1,8 m con una larghezza di fila di 0,9 m utilizzando 10 semi per appezzamento. Due file di confine sono state piantate attorno al perimetro di ciascun esperimento per prevenire effetti di bordo. Gli esperimenti sono stati inoculati il 20 luglio 2017 e il 20 luglio 2018, momento in cui le piante di sorgo erano allo stadio di crescita 3. Le valutazioni sono state prese su una scala da uno a nove, dove le piante che non mostravano segni di malattia sono state valutate come nove e le piante completamente morte sono state valutate come uno. Sono state prese due valutazioni nel 2017 e quattro letture nel 2018 a partire da due settimane dopo l'inoculazione ogni anno. L'sAUDPC (area standardizzata sotto la curva di progressione della malattia) è stata calcolata come descritto in precedenza.
Data di pubblicazione: 01-04-2021