La leishmaniosi viscerale (LV), nota come kala-azar nel subcontinente indiano, è una malattia parassitaria causata dal protozoo flagellato Leishmania, che può essere fatale se non trattata tempestivamente. Il flebotomo Phlebotomus argentipes è l'unico vettore confermato della LV nel Sud-est asiatico, dove viene controllato con l'irrorazione residuale indoor (IRS), un insetticida sintetico. L'uso del DDT nei programmi di controllo della LV ha portato allo sviluppo di resistenza nei flebotomi, quindi il DDT è stato sostituito dall'insetticida alfa-cipermetrina. Tuttavia, l'alfa-cipermetrina agisce in modo simile al DDT, quindi il rischio di resistenza nei flebotomi aumenta in caso di stress causato da ripetuta esposizione a questo insetticida. In questo studio, abbiamo valutato la suscettibilità delle zanzare selvatiche e della loro progenie F1 utilizzando il biotest in bottiglia del CDC.
Abbiamo raccolto zanzare da 10 villaggi nel distretto di Muzaffarpur, nel Bihar, in India. Otto villaggi hanno continuato a utilizzare insetticidi ad alta potenza.cipermetrinaPer quanto riguarda l'irrorazione indoor, un villaggio ha smesso di utilizzare cipermetrina ad alta potenza per l'irrorazione indoor, mentre un altro villaggio non l'ha mai utilizzata. Le zanzare raccolte sono state esposte a una dose diagnostica predefinita per un tempo definito (3 μg/ml per 40 minuti) e il tasso di abbattimento e mortalità sono stati registrati 24 ore dopo l'esposizione.
Il tasso di mortalità delle zanzare selvatiche variava dal 91,19% al 99,47%, mentre quello delle loro generazioni F1 variava dal 91,70% al 98,89%. Ventiquattro ore dopo l'esposizione, la mortalità delle zanzare selvatiche variava dall'89,34% al 98,93%, mentre quella della loro generazione F1 variava dal 90,16% al 98,33%.
I risultati di questo studio indicano che potrebbe svilupparsi una resistenza in P. argentipes, evidenziando la necessità di un monitoraggio e di una vigilanza continui per mantenere il controllo una volta ottenuta l'eradicazione.
La leishmaniosi viscerale (LV), nota come kala-azar nel subcontinente indiano, è una malattia parassitaria causata dal protozoo flagellato Leishmania e trasmessa attraverso la puntura di flebotomi femmine infette (Diptera: Myrmecophaga). I flebotomi sono l'unico vettore confermato della VL nel Sud-est asiatico. L'India è vicina al raggiungimento dell'obiettivo di eradicazione della VL. Tuttavia, per mantenere bassi i tassi di incidenza dopo l'eradicazione, è fondamentale ridurre la popolazione dei vettori per prevenire la potenziale trasmissione.
Il controllo delle zanzare nel Sud-est asiatico viene effettuato attraverso l'irrorazione residua indoor (IRS) utilizzando insetticidi sintetici. Il comportamento di riposo riservato delle zanzare argentate le rende un bersaglio adatto per il controllo degli insetticidi attraverso l'irrorazione residua indoor [1]. L'irrorazione residua indoor di diclorodifeniltricloroetano (DDT) nell'ambito del Programma Nazionale di Controllo della Malaria in India ha avuto significativi effetti di ricaduta nel controllo delle popolazioni di zanzare e nella riduzione significativa dei casi di VL [2]. Questo controllo non pianificato della VL ha spinto il Programma Indiano di Eradicazione della VL ad adottare l'irrorazione residua indoor come metodo principale per il controllo delle zanzare argentate. Nel 2005, i governi di India, Bangladesh e Nepal hanno firmato un memorandum d'intesa con l'obiettivo di eliminare la VL entro il 2015 [3]. Gli sforzi di eradicazione, che prevedono una combinazione di controllo dei vettori e diagnosi e trattamento rapidi dei casi umani, miravano a entrare nella fase di consolidamento entro il 2015, un obiettivo successivamente rivisto al 2017 e poi al 2020.[4] La nuova tabella di marcia globale per eliminare le malattie tropicali neglette include l’eliminazione della VL entro il 2030.[5]
Con l'entrata dell'India nella fase di post-eradicazione della BCVD, è fondamentale garantire che non si sviluppi una resistenza significativa alla beta-cipermetrina. La ragione di tale resistenza è che sia il DDT che la cipermetrina hanno lo stesso meccanismo d'azione, ovvero agiscono sulla proteina VGSC[21]. Pertanto, il rischio di sviluppo di resistenza nei flebotomi può essere aumentato dallo stress causato dall'esposizione regolare alla cipermetrina altamente potente. È quindi fondamentale monitorare e identificare potenziali popolazioni di flebotomi resistenti a questo insetticida. In questo contesto, l'obiettivo di questo studio era monitorare lo stato di suscettibilità dei flebotomi selvatici utilizzando dosi diagnostiche e durate di esposizione determinate da Chaubey et al. [20] che hanno studiato P. argentipes in diversi villaggi del distretto di Muzaffarpur, nel Bihar, in India, che utilizzavano continuamente sistemi di irrorazione indoor trattati con cipermetrina (villaggi con IPS continuo). Lo stato di suscettibilità del P. argentipes selvatico proveniente da villaggi che avevano smesso di utilizzare sistemi di irrorazione indoor trattati con cipermetrina (ex villaggi IPS) e da quelli che non avevano mai utilizzato sistemi di irrorazione indoor trattati con cipermetrina (villaggi non IPS) è stato confrontato utilizzando il biotest in bottiglia del CDC.
Per lo studio sono stati selezionati dieci villaggi (Fig. 1; Tabella 1), di cui otto presentavano una storia di irrorazione continua di piretroidi sintetici (ipermetrina; designati come villaggi con ipermetrina continua) e avevano avuto casi di leucemia linfatica cronica (almeno un caso) negli ultimi 3 anni. Dei restanti due villaggi oggetto dello studio, un villaggio che non aveva implementato l'irrorazione di beta-cipermetrina in ambienti chiusi (villaggio non irrorato in ambienti chiusi) è stato selezionato come villaggio di controllo, mentre l'altro villaggio che aveva effettuato un'irrorazione intermittente di beta-cipermetrina in ambienti chiusi (villaggio con irrorazione intermittente in ambienti chiusi/ex villaggio con irrorazione in ambienti chiusi) è stato selezionato come villaggio di controllo. La selezione di questi villaggi si è basata sul coordinamento con il Dipartimento della Salute e il Team per l'Irrorazione in Ambienti Chiusi e sulla convalida del Micro Piano d'Azione per l'Irrorazione in Ambienti Chiusi nel Distretto di Muzaffarpur.
Mappa geografica del distretto di Muzaffarpur che mostra l'ubicazione dei villaggi inclusi nello studio (1–10). Località di studio: 1, Manifulkaha; 2, Ramdas Majhauli; 3, Madhubani; 4, Anandpur Haruni; 5, Pandey; 6, Hirapur; 7, Madhopur Hazari; 8, Hamidpur; 9, Noonfara; 10, Simara. La mappa è stata realizzata utilizzando il software QGIS (versione 3.30.3) e il formato Open Assessment Shapefile.
Le bottiglie per gli esperimenti di esposizione sono state preparate secondo i metodi di Chaubey et al. [20] e Denlinger et al. [22]. In breve, bottiglie di vetro da 500 mL sono state preparate un giorno prima dell'esperimento e la parete interna delle bottiglie è stata rivestita con l'insetticida indicato (la dose diagnostica di α-cipermetrina era di 3 μg/mL) applicando una soluzione acetonica dell'insetticida (2,0 mL) sul fondo, sulle pareti e sul tappo delle bottiglie. Ogni bottiglia è stata quindi asciugata su un rullo meccanico per 30 minuti. Durante questo periodo, svitare lentamente il tappo per consentire all'acetone di evaporare. Dopo 30 minuti di asciugatura, rimuovere il tappo e ruotare la bottiglia fino a quando tutto l'acetone non è evaporato. Le bottiglie sono state quindi lasciate aperte ad asciugare per una notte. Per ogni test replicato, una bottiglia, utilizzata come controllo, è stata rivestita con 2,0 mL di acetone. Tutte le bottiglie sono state riutilizzate durante gli esperimenti dopo un'adeguata pulizia secondo la procedura descritta da Denlinger et al. e dall'Organizzazione Mondiale della Sanità [ 22 , 23 ].
Il giorno successivo alla preparazione dell'insetticida, 30-40 zanzare catturate in natura (femmine affamate) sono state rimosse dalle gabbie contenute in fiale e delicatamente soffiate in ciascuna fiala. Per ogni flacone rivestito di insetticida è stato utilizzato approssimativamente lo stesso numero di mosche, incluso il controllo. Ripetere questa operazione almeno cinque o sei volte in ogni villaggio. Dopo 40 minuti di esposizione all'insetticida, è stato registrato il numero di mosche abbattute. Tutte le mosche sono state catturate con un aspiratore meccanico, poste in contenitori di cartone da una pinta coperti da una rete a maglie fini e poste in un'incubatrice separata alle stesse condizioni di umidità e temperatura e con la stessa fonte di cibo (batuffoli di cotone imbevuti in una soluzione zuccherina al 30%) delle colonie non trattate. La mortalità è stata registrata 24 ore dopo l'esposizione all'insetticida. Tutte le zanzare sono state sezionate ed esaminate per confermare l'identità della specie. La stessa procedura è stata eseguita con le mosche della progenie F1. I tassi di abbattimento e mortalità sono stati registrati 24 ore dopo l'esposizione. Se la mortalità nei flaconi di controllo era < 5%, non veniva effettuata alcuna correzione della mortalità nei replicati. Se la mortalità nel flacone di controllo era ≥ 5% e ≤ 20%, la mortalità nei flaconi di prova di quel replicato veniva corretta utilizzando la formula di Abbott. Se la mortalità nel gruppo di controllo superava il 20%, l'intero gruppo di prova veniva scartato [24, 25, 26].
Mortalità media delle zanzare P. argentipes catturate in natura. Le barre di errore rappresentano gli errori standard della media. L'intersezione delle due linee orizzontali rosse con il grafico (rispettivamente 90% e 98% di mortalità) indica la finestra di mortalità in cui può svilupparsi resistenza.[25]
Mortalità media della progenie F1 di P. argentipes catturato in natura. Le barre di errore rappresentano gli errori standard della media. Le curve intersecate dalle due linee orizzontali rosse (rispettivamente 90% e 98% di mortalità) rappresentano l'intervallo di mortalità entro il quale può svilupparsi resistenza[25].
Le zanzare nel villaggio di controllo/non IRS (Manifulkaha) sono risultate altamente sensibili agli insetticidi. La mortalità media (±SE) delle zanzare catturate allo stato selvatico 24 ore dopo l'abbattimento e l'esposizione è stata rispettivamente del 99,47 ± 0,52% e del 98,93 ± 0,65%, mentre la mortalità media della prole F1 è stata rispettivamente del 98,89 ± 1,11% e del 98,33 ± 1,11% (Tabelle 2 e 3).
I risultati di questo studio indicano che i flebotomi dalle zampe argentate possono sviluppare resistenza al piretroide sintetico (SP) α-cipermetrina nei villaggi in cui il piretroide (SP) α-cipermetrina veniva utilizzato di routine. Al contrario, i flebotomi dalle zampe argentate raccolti da villaggi non coperti dal programma IRS/controllo sono risultati altamente suscettibili. Il monitoraggio della suscettibilità delle popolazioni di flebotomi selvatici è importante per monitorare l'efficacia degli insetticidi utilizzati, poiché queste informazioni possono aiutare a gestire la resistenza agli insetticidi. Alti livelli di resistenza al DDT sono stati regolarmente segnalati nei flebotomi provenienti da aree endemiche del Bihar a causa della pressione selettiva storica da parte dell'IRS che utilizza questo insetticida [ 1 ].
Abbiamo scoperto che P. argentipes è altamente sensibile ai piretroidi e le prove sul campo in India, Bangladesh e Nepal hanno dimostrato che l'IRS aveva un'elevata efficacia entomologica quando usato in combinazione con cipermetrina o deltametrina [19, 26, 27, 28, 29]. Recentemente, Roy et al. [18] hanno riferito che P. argentipes aveva sviluppato resistenza ai piretroidi in Nepal. Il nostro studio sulla suscettibilità sul campo ha mostrato che i flebotomi dalle zampe argentate raccolti da villaggi non esposti a IRS erano altamente suscettibili, ma le mosche raccolte da villaggi con IRS intermittente/ex e IRS continuo (la mortalità variava dal 90% al 97% ad eccezione dei flebotomi di Anandpur-Haruni che avevano una mortalità dell'89,34% a 24 ore dall'esposizione) erano probabilmente resistenti alla cipermetrina altamente efficace [25]. Una possibile ragione per lo sviluppo di questa resistenza è la pressione esercitata dalla nebulizzazione di routine indoor (IRS) e dai programmi di nebulizzazione locale basati sui casi, che sono procedure standard per la gestione delle epidemie di kala-azar in aree/isolati/villaggi endemici (procedura operativa standard per l'indagine e la gestione delle epidemie [30]. I risultati di questo studio forniscono le prime indicazioni dello sviluppo di una pressione selettiva contro la cipermetrina altamente efficace. Sfortunatamente, i dati storici sulla suscettibilità per questa regione, ottenuti utilizzando il biotest su bottiglia CDC, non sono disponibili per il confronto; tutti gli studi precedenti hanno monitorato la suscettibilità di P. argentipes utilizzando carta impregnata di insetticida dell'OMS. Le dosi diagnostiche di insetticidi nelle strisce reattive dell'OMS sono le concentrazioni di identificazione raccomandate di insetticidi da utilizzare contro i vettori della malaria (Anopheles gambiae) e l'applicabilità operativa di queste concentrazioni ai pappataci non è chiara perché i pappataci volano meno frequentemente delle zanzare e trascorrono più tempo a contatto con il substrato nel biotest [23].
I piretroidi sintetici sono stati utilizzati nelle aree endemiche del Nepal con VL dal 1992, alternati con gli SP alfa-cipermetrina e lambda-cialotrina per il controllo dei pappataci [31], e la deltametrina è stata utilizzata anche in Bangladesh dal 2012 [32]. La resistenza fenotipica è stata rilevata nelle popolazioni selvatiche di pappataci dalle zampe argentate in aree in cui i piretroidi sintetici sono stati utilizzati per lungo tempo [18, 33, 34]. Una mutazione non sinonima (L1014F) è stata rilevata nelle popolazioni selvatiche del pappatacio indiano ed è stata associata alla resistenza al DDT, suggerendo che la resistenza ai piretroidi si manifesta a livello molecolare, poiché sia il DDT che il piretroide (alfa-cipermetrina) prendono di mira lo stesso gene nel sistema nervoso degli insetti [17, 34]. Pertanto, durante i periodi di eradicazione e post-eradicazione, è essenziale una valutazione sistematica della suscettibilità alla cipermetrina e il monitoraggio della resistenza delle zanzare.
Un potenziale limite di questo studio è che abbiamo utilizzato il biotest in fiala del CDC per misurare la suscettibilità, ma tutti i confronti hanno utilizzato risultati di studi precedenti che utilizzavano il kit di biotest dell'OMS. I risultati dei due biotest potrebbero non essere direttamente confrontabili perché il biotest in fiala del CDC misura l'abbattimento alla fine del periodo diagnostico, mentre il biotest del kit dell'OMS misura la mortalità a 24 o 72 ore dopo l'esposizione (quest'ultima per composti ad azione lenta) [35]. Un altro potenziale limite è il numero di villaggi IRS in questo studio rispetto a un villaggio non IRS e un villaggio non IRS/ex IRS. Non possiamo presumere che il livello di suscettibilità al vettore zanzara osservato nei singoli villaggi di un distretto sia rappresentativo del livello di suscettibilità in altri villaggi e distretti del Bihar. Poiché l'India entra nella fase di post-eliminazione del virus della leucemia, è imperativo prevenire uno sviluppo significativo di resistenza. È necessario un rapido monitoraggio della resistenza nelle popolazioni di pappataci di diversi distretti, blocchi e aree geografiche. I dati presentati in questo studio sono preliminari e dovrebbero essere verificati mediante confronto con le concentrazioni di identificazione pubblicate dall'Organizzazione Mondiale della Sanità [35] per avere un'idea più specifica dello stato di suscettibilità di P. argentipes in queste aree prima di modificare i programmi di controllo dei vettori per mantenere basse le popolazioni di pappataci e supportare l'eliminazione del virus della leucemia.
La zanzara P. argentipes, vettore del virus della leucosi, potrebbe iniziare a mostrare i primi segni di resistenza alla cipermetrina, un farmaco altamente efficace. Il monitoraggio regolare della resistenza agli insetticidi nelle popolazioni selvatiche di P. argentipes è necessario per mantenere l'impatto epidemiologico degli interventi di controllo dei vettori. La rotazione di insetticidi con diverse modalità d'azione e/o la valutazione e la registrazione di nuovi insetticidi sono necessarie e raccomandate per gestire la resistenza agli insetticidi e favorire l'eliminazione del virus della leucosi in India.
Data di pubblicazione: 17 febbraio 2025