La leishmaniosi viscerale (LV), nota come kala-azar nel subcontinente indiano, è una malattia parassitaria causata dal protozoo flagellato Leishmania che può essere fatale se non trattata tempestivamente. Il flebotomo Phlebotomus argentipes è l'unico vettore confermato della LV nel Sud-est asiatico, dove viene controllata mediante irrorazione residua in ambienti chiusi (IRS), un insetticida sintetico. L'uso del DDT nei programmi di controllo della LV ha portato allo sviluppo di resistenza nei flebotomi, pertanto il DDT è stato sostituito dall'insetticida alfa-cipermetrina. Tuttavia, l'alfa-cipermetrina agisce in modo simile al DDT, quindi il rischio di resistenza nei flebotomi aumenta in condizioni di stress causate da ripetute esposizioni a questo insetticida. In questo studio, abbiamo valutato la suscettibilità delle zanzare selvatiche e della loro progenie F1 utilizzando il bioassay in bottiglia del CDC.
Abbiamo raccolto zanzare da 10 villaggi nel distretto di Muzaffarpur nel Bihar, in India. Otto villaggi hanno continuato a utilizzare insetticidi ad alta potenzacipermetrinaPer quanto riguarda la disinfestazione degli ambienti interni, un villaggio ha smesso di utilizzare la cipermetrina ad alta potenza, mentre un altro villaggio non l'ha mai utilizzata. Le zanzare raccolte sono state esposte a una dose diagnostica predefinita per un tempo definito (3 μg/ml per 40 minuti) e il tasso di abbattimento e la mortalità sono stati registrati 24 ore dopo l'esposizione.
Il tasso di mortalità delle zanzare selvatiche variava dal 91,19% al 99,47%, mentre quello della generazione F1 variava dal 91,70% al 98,89%. Ventiquattro ore dopo l'esposizione, la mortalità delle zanzare selvatiche variava dall'89,34% al 98,93%, mentre quella della generazione F1 variava dal 90,16% al 98,33%.
I risultati di questo studio indicano che in P. argentipes può svilupparsi resistenza, il che sottolinea la necessità di un monitoraggio e di una vigilanza continui per mantenere il controllo una volta raggiunta l'eradicazione.
La leishmaniosi viscerale (LV), nota come kala-azar nel subcontinente indiano, è una malattia parassitaria causata dal protozoo flagellato Leishmania e trasmessa attraverso la puntura di flebotomi femmina infetti (Diptera: Myrmecophaga). I flebotomi sono l'unico vettore confermato della LV nel Sud-est asiatico. L'India è vicina a raggiungere l'obiettivo di eliminare la LV. Tuttavia, per mantenere bassi i tassi di incidenza dopo l'eradicazione, è fondamentale ridurre la popolazione del vettore per prevenire potenziali trasmissioni.
Il controllo delle zanzare nel Sud-est asiatico viene effettuato tramite irrorazione residua interna (IRS) con insetticidi sintetici. Il comportamento di riposo elusivo delle zanzare argentate le rende un bersaglio adatto per il controllo con insetticidi tramite irrorazione residua interna [1]. L'irrorazione residua interna di diclorodifeniltricloroetano (DDT) nell'ambito del Programma nazionale di controllo della malaria in India ha avuto effetti di ricaduta significativi nel controllo delle popolazioni di zanzare e nella significativa riduzione dei casi di leishmaniosi viscerale (LV) [2]. Questo controllo non pianificato della LV ha spinto il Programma indiano di eradicazione della LV ad adottare l'irrorazione residua interna come metodo primario di controllo delle zanzare argentate. Nel 2005, i governi di India, Bangladesh e Nepal hanno firmato un memorandum d'intesa con l'obiettivo di eliminare la LV entro il 2015 [3]. Gli sforzi di eradicazione, che prevedono una combinazione di controllo dei vettori e diagnosi e trattamento rapidi dei casi umani, miravano ad entrare nella fase di consolidamento entro il 2015, un obiettivo successivamente rivisto al 2017 e poi al 2020 [4]. La nuova tabella di marcia globale per eliminare le malattie tropicali neglette include l'eliminazione della leishmaniosi viscerale entro il 2030.[5]
Poiché l'India entra nella fase post-eradicazione della BCVD, è imperativo garantire che non si sviluppi una significativa resistenza alla beta-cipermetrina. La ragione della resistenza è che sia il DDT che la cipermetrina hanno lo stesso meccanismo d'azione, ovvero prendono di mira la proteina VGSC[21]. Pertanto, il rischio di sviluppo di resistenza nei flebotomi può essere aumentato dallo stress causato dalla regolare esposizione alla cipermetrina altamente potente. È quindi imperativo monitorare e identificare le potenziali popolazioni di flebotomi resistenti a questo insetticida. In questo contesto, l'obiettivo di questo studio era monitorare lo stato di suscettibilità dei flebotomi selvatici utilizzando dosi diagnostiche e durate di esposizione determinate da Chaubey et al. [20] hanno studiato P. argentipes in diversi villaggi del distretto di Muzaffarpur nel Bihar, in India, che utilizzavano continuamente sistemi di irrorazione indoor trattati con cipermetrina (villaggi IPS continui). Lo stato di suscettibilità di esemplari selvatici di P. argentipes provenienti da villaggi che avevano interrotto l'uso di sistemi di irrorazione indoor trattati con cipermetrina (ex villaggi IPS) e da quelli che non avevano mai utilizzato tali sistemi (villaggi non-IPS) è stato confrontato mediante il bioassay in bottiglia del CDC.
Dieci villaggi sono stati selezionati per lo studio (Fig. 1; Tabella 1), di cui otto avevano una storia di irrorazione continua di piretroidi sintetici (ipermetrina) all'interno delle abitazioni (denominati villaggi con irrorazione continua di ipermetrina) e avevano avuto casi di leishmaniosi viscerale (almeno un caso) negli ultimi 3 anni. Dei due villaggi rimanenti nello studio, un villaggio che non aveva implementato l'irrorazione di beta-cipermetrina all'interno delle abitazioni (villaggio senza irrorazione all'interno delle abitazioni) è stato selezionato come villaggio di controllo e l'altro villaggio che aveva effettuato irrorazioni intermittenti di beta-cipermetrina all'interno delle abitazioni (villaggio con irrorazione intermittente all'interno delle abitazioni/ex villaggio con irrorazione all'interno delle abitazioni) è stato selezionato come villaggio di controllo. La selezione di questi villaggi si è basata sul coordinamento con il Dipartimento della Salute e il Team per l'Irrorazione all'interno delle abitazioni e sulla convalida del Micro Piano d'Azione per l'Irrorazione all'interno delle abitazioni nel distretto di Muzaffarpur.
Mappa geografica del distretto di Muzaffarpur che mostra l'ubicazione dei villaggi inclusi nello studio (1-10). Località di studio: 1, Manifulkaha; 2, Ramdas Majhauli; 3, Madhubani; 4, Anandpur Haruni; 5, Pandey; 6, Hirapur; 7, Madhopur Hazari; 8, Hamidpur; 9, Noonfara; 10, Simara. La mappa è stata realizzata utilizzando il software QGIS (versione 3.30.3) e Open Assessment Shapefile.
Le bottiglie per gli esperimenti di esposizione sono state preparate secondo i metodi di Chaubey et al. [20] e Denlinger et al. [22]. In breve, bottiglie di vetro da 500 mL sono state preparate un giorno prima dell'esperimento e la parete interna delle bottiglie è stata rivestita con l'insetticida indicato (la dose diagnostica di α-cipermetrina era di 3 μg/mL) applicando una soluzione di acetone dell'insetticida (2,0 mL) sul fondo, sulle pareti e sul tappo delle bottiglie. Ogni bottiglia è stata quindi asciugata su un rullo meccanico per 30 minuti. Durante questo tempo, svitare lentamente il tappo per consentire all'acetone di evaporare. Dopo 30 minuti di asciugatura, rimuovere il tappo e ruotare la bottiglia fino a completa evaporazione dell'acetone. Le bottiglie sono state quindi lasciate aperte ad asciugare durante la notte. Per ogni test replicato, una bottiglia, utilizzata come controllo, è stata rivestita con 2,0 mL di acetone. Tutte le bottiglie sono state riutilizzate nel corso degli esperimenti dopo un'adeguata pulizia secondo la procedura descritta da Denlinger et al. e dall'Organizzazione Mondiale della Sanità [ 22 , 23 ].
Il giorno successivo alla preparazione dell'insetticida, 30-40 zanzare selvatiche (femmine a digiuno) sono state prelevate dalle gabbie in provette e delicatamente soffiate in ciascuna provetta. Per ogni provetta trattata con l'insetticida, incluso il controllo, è stato utilizzato all'incirca lo stesso numero di mosche. Questa procedura è stata ripetuta almeno cinque o sei volte in ogni villaggio. Dopo 40 minuti di esposizione all'insetticida, è stato registrato il numero di mosche abbattute. Tutte le mosche sono state catturate con un aspiratore meccanico, poste in contenitori di cartone da mezzo litro coperti con una rete a maglie fini e collocate in un incubatore separato, nelle stesse condizioni di umidità e temperatura e con la stessa fonte di cibo (batuffoli di cotone imbevuti in una soluzione zuccherina al 30%) delle colonie non trattate. La mortalità è stata registrata 24 ore dopo l'esposizione all'insetticida. Tutte le zanzare sono state dissezionate ed esaminate per confermare l'identità della specie. La stessa procedura è stata eseguita con le mosche della progenie F1. I tassi di abbattimento e mortalità sono stati registrati 24 ore dopo l'esposizione. Se la mortalità nelle bottiglie di controllo era < 5%, non veniva effettuata alcuna correzione della mortalità nelle repliche. Se la mortalità nella bottiglia di controllo era ≥ 5% e ≤ 20%, la mortalità nelle bottiglie di prova di quella replica veniva corretta utilizzando la formula di Abbott. Se la mortalità nel gruppo di controllo superava il 20%, l'intero gruppo di prova veniva scartato [24, 25, 26].
Mortalità media delle zanzare P. argentipes catturate in natura. Le barre di errore rappresentano gli errori standard della media. L'intersezione delle due linee orizzontali rosse con il grafico (mortalità del 90% e del 98%, rispettivamente) indica la finestra di mortalità in cui può svilupparsi la resistenza.[25]
Mortalità media della progenie F1 di P. argentipes catturato in natura. Le barre di errore rappresentano gli errori standard della media. Le curve intersecate dalle due linee orizzontali rosse (mortalità del 90% e del 98%, rispettivamente) rappresentano l'intervallo di mortalità in cui può svilupparsi la resistenza[25].
È stato riscontrato che le zanzare nel villaggio di controllo/non-IRS (Manifulkaha) erano altamente sensibili agli insetticidi. La mortalità media (±SE) delle zanzare catturate in natura 24 ore dopo l'abbattimento e l'esposizione è stata rispettivamente del 99,47 ± 0,52% e del 98,93 ± 0,65%, e la mortalità media della prole F1 è stata rispettivamente del 98,89 ± 1,11% e del 98,33 ± 1,11% (Tabelle 2, 3).
I risultati di questo studio indicano che i flebotomi dalle zampe argentate possono sviluppare resistenza al piretroide sintetico (SP) α-cipermetrina nei villaggi in cui il piretroide (SP) α-cipermetrina è stato utilizzato di routine. Al contrario, i flebotomi dalle zampe argentate raccolti nei villaggi non coperti dal programma di irrorazione/controllo sono risultati altamente suscettibili. Il monitoraggio della suscettibilità delle popolazioni di flebotomi selvatici è importante per monitorare l'efficacia degli insetticidi utilizzati, poiché queste informazioni possono aiutare a gestire la resistenza agli insetticidi. Alti livelli di resistenza al DDT sono stati regolarmente segnalati nei flebotomi provenienti da aree endemiche del Bihar a causa della pressione selettiva storica esercitata dall'IRS utilizzando questo insetticida [ 1 ].
Abbiamo scoperto che P. argentipes è altamente sensibile ai piretroidi e le prove sul campo in India, Bangladesh e Nepal hanno dimostrato che l'IRS ha un'elevata efficacia entomologica se usato in combinazione con cipermetrina o deltametrina [19, 26, 27, 28, 29]. Recentemente, Roy et al. [18] hanno riferito che P. argentipes ha sviluppato resistenza ai piretroidi in Nepal. Il nostro studio sulla suscettibilità sul campo ha mostrato che i flebotomi dalle zampe argentate raccolti da villaggi non esposti all'IRS erano altamente suscettibili, ma i flebotomi raccolti da villaggi con IRS intermittente/ex IRS e IRS continuo (la mortalità variava dal 90% al 97% tranne per i flebotomi di Anandpur-Haruni che avevano l'89,34% di mortalità a 24 ore dall'esposizione) erano probabilmente resistenti alla cipermetrina altamente efficace [25]. Una possibile ragione dello sviluppo di questa resistenza è la pressione esercitata dalla disinfestazione di routine degli ambienti interni (IRS) e dai programmi di disinfestazione locale basati sui casi, che sono procedure standard per la gestione delle epidemie di kala-azar nelle aree/blocchi/villaggi endemici (Procedura operativa standard per l'indagine e la gestione delle epidemie [30]). I risultati di questo studio forniscono le prime indicazioni dello sviluppo di una pressione selettiva contro la cipermetrina altamente efficace. Sfortunatamente, i dati storici sulla suscettibilità per questa regione, ottenuti utilizzando il bioassay in bottiglia del CDC, non sono disponibili per il confronto; tutti gli studi precedenti hanno monitorato la suscettibilità di P. argentipes utilizzando carta impregnata di insetticida dell'OMS. Le dosi diagnostiche di insetticidi nelle strisce di prova dell'OMS sono le concentrazioni di identificazione raccomandate di insetticidi da utilizzare contro i vettori della malaria (Anopheles gambiae), e l'applicabilità operativa di queste concentrazioni ai flebotomi non è chiara perché i flebotomi volano meno frequentemente delle zanzare e trascorrono più tempo a contatto con il substrato nel bioassay [23].
I piretroidi sintetici sono stati utilizzati nelle aree endemiche di leishmaniosi viscerale del Nepal dal 1992, alternandosi con gli SP alfa-cipermetrina e lambda-cialotrina per il controllo dei flebotomi [31], e la deltametrina è stata utilizzata anche in Bangladesh dal 2012 [32]. La resistenza fenotipica è stata rilevata nelle popolazioni selvatiche di flebotomi dalle zampe argentate nelle aree in cui i piretroidi sintetici sono stati utilizzati per lungo tempo [18, 33, 34]. Una mutazione non sinonima (L1014F) è stata rilevata nelle popolazioni selvatiche del flebotomo indiano ed è stata associata alla resistenza al DDT, suggerendo che la resistenza ai piretroidi si sviluppa a livello molecolare, poiché sia il DDT che il piretroide (alfa-cipermetrina) prendono di mira lo stesso gene nel sistema nervoso dell'insetto [17, 34]. Pertanto, la valutazione sistematica della suscettibilità alla cipermetrina e il monitoraggio della resistenza delle zanzare sono essenziali durante le fasi di eradicazione e post-eradicazione.
Un potenziale limite di questo studio è che abbiamo utilizzato il bioassay in fiala del CDC per misurare la suscettibilità, ma tutti i confronti hanno utilizzato i risultati di studi precedenti che utilizzavano il kit di bioassay dell'OMS. I risultati dei due bioassay potrebbero non essere direttamente confrontabili perché il bioassay in fiala del CDC misura l'abbattimento alla fine del periodo diagnostico, mentre il bioassay del kit dell'OMS misura la mortalità a 24 o 72 ore dopo l'esposizione (quest'ultimo per i composti ad azione lenta) [35]. Un altro potenziale limite è il numero di villaggi IRS in questo studio rispetto a un villaggio non IRS e un villaggio non IRS/ex IRS. Non possiamo presumere che il livello di suscettibilità del vettore zanzara osservato nei singoli villaggi di un distretto sia rappresentativo del livello di suscettibilità in altri villaggi e distretti del Bihar. Poiché l'India sta entrando nella fase post-eliminazione del virus della leucemia, è imperativo prevenire un significativo sviluppo di resistenza. È necessario un rapido monitoraggio della resistenza nelle popolazioni di flebotomi provenienti da diversi distretti, blocchi e aree geografiche. I dati presentati in questo studio sono preliminari e dovrebbero essere verificati confrontandoli con le concentrazioni di identificazione pubblicate dall'Organizzazione Mondiale della Sanità [35] per ottenere un'idea più specifica dello stato di suscettibilità di P. argentipes in queste aree prima di modificare i programmi di controllo dei vettori per mantenere basse le popolazioni di flebotomi e supportare l'eliminazione del virus della leucemia.
La zanzara P. argentipes, vettore del virus della leucosi, potrebbe iniziare a mostrare i primi segni di resistenza alla cipermetrina, un insetticida altamente efficace. Il monitoraggio regolare della resistenza agli insetticidi nelle popolazioni selvatiche di P. argentipes è necessario per mantenere l'impatto epidemiologico degli interventi di controllo del vettore. La rotazione di insetticidi con diversi meccanismi d'azione e/o la valutazione e la registrazione di nuovi insetticidi sono necessarie e raccomandate per gestire la resistenza agli insetticidi e supportare l'eliminazione del virus della leucosi in India.
Data di pubblicazione: 17 febbraio 2025