Questo studio ha valutato la letalità, la subletalità e la tossicità dei farmaci commercialicipermetrinaformulazioni per girini di anuri. Nel test acuto, concentrazioni di 100-800 μg/L sono state testate per 96 ore. Nel test cronico, concentrazioni di cipermetrina naturale (1, 3, 6 e 20 μg/L) sono state testate per la mortalità, seguite da test del micronucleo e anomalie nucleari dei globuli rossi per 7 giorni. La LC50 della formulazione commerciale di cipermetrina per girini è stata di 273,41 μg L−1. Nel test cronico, la concentrazione più elevata (20 μg L−1) ha causato una mortalità superiore al 50%, poiché ha ucciso metà dei girini testati. Il test del micronucleo ha mostrato risultati significativi a 6 e 20 μg L−1 e sono state rilevate diverse anomalie nucleari, indicando che la formulazione commerciale di cipermetrina ha un potenziale genotossico contro P. gracilis. La cipermetrina rappresenta un rischio elevato per questa specie, il che indica che può causare molteplici problemi e influenzare le dinamiche di questo ecosistema a breve e lungo termine. Pertanto, si può concludere che le formulazioni commerciali di cipermetrina hanno effetti tossici su P. gracilis.
A causa della continua espansione delle attività agricole e dell'applicazione intensiva dicontrollo dei parassitimisure, gli animali acquatici sono frequentemente esposti ai pesticidi1,2. L'inquinamento delle risorse idriche in prossimità dei campi agricoli può influire sullo sviluppo e sulla sopravvivenza di organismi non bersaglio come gli anfibi.
Gli anfibi stanno acquisendo sempre più importanza nella valutazione delle matrici ambientali. Gli anuri sono considerati buoni bioindicatori di inquinanti ambientali grazie alle loro caratteristiche uniche come cicli vitali complessi, rapidi tassi di crescita larvale, stato trofico, pelle permeabile10,11, dipendenza dall'acqua per la riproduzione12 e uova non protette11,13,14. La piccola rana d'acqua (Physalaemus gracilis), comunemente nota come rana piangente, ha dimostrato di essere una specie bioindicatrice di inquinamento da pesticidi4,5,6,7,15. La specie si trova in acque stagnanti, aree protette o aree con habitat variabile in Argentina, Uruguay, Paraguay e Brasile1617 ed è considerata stabile dalla classificazione IUCN grazie alla sua ampia distribuzione e tolleranza a diversi habitat18.
Sono stati segnalati effetti subletali negli anfibi a seguito dell'esposizione alla cipermetrina, tra cui alterazioni comportamentali, morfologiche e biochimiche nei girini23,24,25, alterazione della mortalità e del tempo di metamorfosi, alterazioni enzimatiche, riduzione del successo di schiusa24,25, iperattività26, inibizione dell'attività della colinesterasi27 e alterazioni nelle prestazioni natatorie7,28. Tuttavia, gli studi sugli effetti genotossici della cipermetrina negli anfibi sono limitati. Pertanto, è importante valutare la suscettibilità delle specie di anuri alla cipermetrina.
L'inquinamento ambientale influisce sulla normale crescita e sviluppo degli anfibi, ma l'effetto avverso più grave è il danno genetico al DNA causato dall'esposizione ai pesticidi13. L'analisi morfologica delle cellule del sangue è un importante bioindicatore dell'inquinamento e della potenziale tossicità di una sostanza per le specie selvatiche29. Il test del micronucleo è uno dei metodi più comunemente utilizzati per determinare la genotossicità delle sostanze chimiche nell'ambiente30. Si tratta di un metodo rapido, efficace ed economico che rappresenta un buon indicatore dell'inquinamento chimico di organismi come gli anfibi31,32 e può fornire informazioni sull'esposizione a inquinanti genotossici33.
L'obiettivo di questo studio era valutare il potenziale tossico delle formulazioni commerciali di cipermetrina sui piccoli girini acquatici mediante un test del micronucleo e una valutazione del rischio ecologico.
Mortalità cumulativa (%) dei girini di P. gracilis esposti a diverse concentrazioni di cipermetrina commerciale durante il periodo acuto del test.
Mortalità cumulativa (%) di girini di P. gracilis esposti a diverse concentrazioni di cipermetrina commerciale durante un test cronico.
L'elevata mortalità osservata è stata il risultato di effetti genotossici negli anfibi esposti a diverse concentrazioni di cipermetrina (6 e 20 μg/L), come evidenziato dalla presenza di micronuclei (MN) e anomalie nucleari negli eritrociti. La formazione di MN indica errori nella mitosi ed è associata a un legame inadeguato dei cromosomi ai microtubuli, a difetti nei complessi proteici responsabili dell'assorbimento e del trasporto dei cromosomi, a errori nella segregazione cromosomica e a errori nella riparazione dei danni al DNA38,39 e può essere correlata allo stress ossidativo indotto da pesticidi40,41. Altre anomalie sono state osservate a tutte le concentrazioni valutate. L'aumento delle concentrazioni di cipermetrina ha aumentato le anomalie nucleari negli eritrociti del 5% e del 20% rispettivamente alle dosi più basse (1 μg/L) e più alte (20 μg/L). Ad esempio, alterazioni del DNA di una specie possono avere gravi conseguenze per la sopravvivenza sia a breve che a lungo termine, con conseguente declino della popolazione, alterazione della capacità riproduttiva, consanguineità, perdita di diversità genetica e alterazione dei tassi di migrazione. Tutti questi fattori possono influire sulla sopravvivenza e il mantenimento della specie42,43. La formazione di anomalie eritroidi può indicare un blocco della citochinesi, con conseguente divisione cellulare anomala (eritrociti binucleati)44,45; i nuclei multilobati sono protrusioni della membrana nucleare con lobi multipli46, mentre altre anomalie eritroidi possono essere associate all'amplificazione del DNA, come i reni/vescicole nucleari47. La presenza di eritrociti anucleati può indicare un trasporto di ossigeno compromesso, soprattutto in acque contaminate48,49. L'apoptosi indica la morte cellulare50.
Altri studi hanno dimostrato gli effetti genotossici della cipermetrina. Kabaña et al.51 hanno dimostrato la presenza di micronuclei e alterazioni nucleari, come cellule binucleate e cellule apoptotiche, in cellule di Odontophrynus americanus dopo esposizione ad alte concentrazioni di cipermetrina (5000 e 10.000 μg L−1) per 96 ore. L'apoptosi indotta da cipermetrina è stata rilevata anche in P. biligonigerus52 e Rhinella arenarum53. Questi risultati suggeriscono che la cipermetrina ha effetti genotossici su una serie di organismi acquatici e che il test MN ed ENA possa essere un indicatore di effetti subletali sugli anfibi e possa essere applicabile a specie autoctone e popolazioni selvatiche esposte a sostanze tossiche12.
Le formulazioni commerciali di cipermetrina rappresentano un elevato rischio ambientale (sia acuto che cronico), con concentrazioni di HQ superiori al livello stabilito dall'Agenzia per la protezione ambientale statunitense (EPA)54, che possono avere effetti negativi sulla specie se presenti nell'ambiente. Nella valutazione del rischio cronico, la NOEC per la mortalità è risultata pari a 3 μg L−1, a conferma che le concentrazioni riscontrate in acqua possono rappresentare un rischio per la specie55. La NOEC letale per le larve di R. arenarum esposte a una miscela di endosulfan e cipermetrina è risultata pari a 500 μg L−1 dopo 168 ore; questo valore è sceso a 0,0005 μg L−1 dopo 336 ore. Gli autori dimostrano che maggiore è l'esposizione, minori sono le concentrazioni dannose per la specie. È inoltre importante sottolineare che i valori di NOEC sono risultati superiori a quelli di P. gracilis allo stesso tempo di esposizione, a indicare che la risposta della specie alla cipermetrina è specie-specifica. Inoltre, in termini di mortalità, il valore di CHQ di P. gracilis dopo esposizione alla cipermetrina ha raggiunto 64,67, un valore superiore al valore di riferimento stabilito dall'Agenzia per la protezione ambientale statunitense54, e anche il valore di CHQ delle larve di R. arenarum era superiore a questo valore (CHQ > 388,00 dopo 336 ore), indicando che gli insetticidi studiati rappresentano un rischio elevato per diverse specie di anfibi. Considerando che P. gracilis richiede circa 30 giorni per completare la metamorfosi56, si può concludere che le concentrazioni di cipermetrina studiate possono contribuire al declino della popolazione impedendo agli individui infetti di entrare nella fase adulta o riproduttiva in età precoce.
Nella valutazione del rischio calcolato di micronuclei e altre anomalie nucleari degli eritrociti, i valori di CHQ variavano da 14,92 a 97,00, indicando che la cipermetrina presentava un potenziale rischio genotossico per P. gracilis anche nel suo habitat naturale. Tenendo conto della mortalità, la concentrazione massima di composti xenobiotici tollerabile per P. gracilis era di 4,24 μg L−1. Tuttavia, anche concentrazioni di soli 1 μg/L hanno mostrato effetti genotossici. Questo fatto potrebbe portare a un aumento del numero di individui anomali57 e influenzare lo sviluppo e la riproduzione delle specie nei loro habitat, portando a un declino delle popolazioni di anfibi.
Le formulazioni commerciali dell'insetticida cipermetrina hanno mostrato un'elevata tossicità acuta e cronica nei confronti di P. gracilis. Sono stati osservati tassi di mortalità più elevati, probabilmente dovuti agli effetti tossici, come evidenziato dalla presenza di micronuclei e anomalie nucleari degli eritrociti, in particolare nuclei seghettati, nuclei lobati e nuclei vescicolari. Inoltre, le specie studiate hanno mostrato maggiori rischi ambientali, sia acuti che cronici. Questi dati, combinati con studi precedenti del nostro gruppo di ricerca, hanno dimostrato che anche diverse formulazioni commerciali di cipermetrina causavano comunque una riduzione dell'attività dell'acetilcolinesterasi (AChE) e della butirrilcolinesterasi (BChE) e dello stress ossidativo58, e provocavano alterazioni dell'attività natatoria e malformazioni orali59 in P. gracilis, indicando che le formulazioni commerciali di cipermetrina presentano un'elevata tossicità letale e subletale per questa specie. Hartmann et al. 60 studi hanno rilevato che le formulazioni commerciali di cipermetrina erano le più tossiche per P. gracilis e un'altra specie dello stesso genere (P. cuvieri) rispetto ad altri nove pesticidi. Ciò suggerisce che concentrazioni di cipermetrina legalmente approvate per la protezione ambientale possono causare un'elevata mortalità e un declino della popolazione a lungo termine.
Sono necessari ulteriori studi per valutare la tossicità del pesticida per gli anfibi, poiché le concentrazioni riscontrate nell'ambiente possono causare un'elevata mortalità e rappresentare un potenziale rischio per P. gracilis. La ricerca sulle specie di anfibi dovrebbe essere incoraggiata, poiché i dati su questi organismi sono scarsi, in particolare sulle specie brasiliane.
Il test di tossicità cronica è durato 168 ore (7 giorni) in condizioni statiche e le concentrazioni subletali erano: 1, 3, 6 e 20 μg ai L−1. In entrambi gli esperimenti, 10 girini per gruppo di trattamento sono stati valutati con sei repliche, per un totale di 60 girini per concentrazione. Nel frattempo, il trattamento con sola acqua è servito da controllo negativo. Ogni apparecchiatura sperimentale consisteva in una capsula di vetro sterile con una capacità di 500 ml e una densità di 1 girino per 50 ml di soluzione. La fiasca era coperta con pellicola di polietilene per prevenire l'evaporazione ed era continuamente aerata.
L'acqua è stata analizzata chimicamente per determinare le concentrazioni di pesticidi a 0, 96 e 168 ore. Secondo Sabin et al. 68 e Martins et al. 69, le analisi sono state eseguite presso il Pesticide Analysis Laboratory (LARP) dell'Università Federale di Santa Maria utilizzando la gascromatografia accoppiata alla spettrometria di massa a triplo quadrupolo (Varian modello 1200, Palo Alto, California, USA). La determinazione quantitativa dei pesticidi nell'acqua è mostrata come materiale supplementare (Tabella SM1).
Per il test del micronucleo (MNT) e il test di anomalia nucleare dei globuli rossi (RNA), sono stati analizzati 15 girini di ciascun gruppo di trattamento. I girini sono stati anestetizzati con lidocaina al 5% (50 mg g-170) e i campioni di sangue sono stati raccolti tramite puntura cardiaca utilizzando siringhe monouso eparinizzate. Gli strisci di sangue sono stati preparati su vetrini da microscopio sterili, asciugati all'aria, fissati con metanolo al 100% (4 °C) per 2 minuti e quindi colorati con soluzione di Giemsa al 10% per 15 minuti al buio. Al termine del processo, i vetrini sono stati lavati con acqua distillata per rimuovere il colorante in eccesso e asciugati a temperatura ambiente.
Almeno 1000 globuli rossi da ciascun girino sono stati analizzati utilizzando un microscopio 100x con obiettivo 71 per determinare la presenza di MN ed ENA. Un totale di 75.796 globuli rossi da girini sono stati valutati considerando le concentrazioni di cipermetrina e i controlli. La genotossicità è stata analizzata secondo il metodo di Carrasco et al. e Fenech et al.38,72 determinando la frequenza delle seguenti lesioni nucleari: (1) cellule anucleate: cellule senza nucleo; (2) cellule apoptotiche: frammentazione nucleare, morte cellulare programmata; (3) cellule binucleate: cellule con due nuclei; (4) gemme nucleari o cellule bleb: cellule con nuclei con piccole protrusioni della membrana nucleare, bleb di dimensioni simili a micronuclei; (5) cellule cariolizzate: cellule con solo il contorno del nucleo senza materiale interno; (6) cellule intagliate: cellule con nuclei con evidenti crepe o incisioni nella loro forma, dette anche nuclei reniformi; (7) cellule lobulate: cellule con protrusioni nucleari più grandi delle vescicole sopra menzionate; e (8) microcellule: cellule con nuclei condensati e citoplasma ridotto. Le alterazioni sono state confrontate con i risultati del controllo negativo.
I risultati del test di tossicità acuta (LC50) sono stati analizzati utilizzando il software GBasic e il metodo TSK-Trimmed Spearman-Karber74. I dati del test cronico sono stati pre-testati per la normalità dell'errore (Shapiro-Wilks) e l'omogeneità della varianza (Bartlett). I risultati sono stati analizzati utilizzando l'analisi della varianza a un fattore (ANOVA). Il test di Tukey è stato utilizzato per confrontare i dati tra loro, mentre il test di Dunnett è stato utilizzato per confrontare i dati tra il gruppo di trattamento e il gruppo di controllo negativo.
I dati LOEC e NOEC sono stati analizzati utilizzando il test di Dunnett. I test statistici sono stati eseguiti utilizzando il software Statistica 8.0 (StatSoft) con un livello di significatività del 95% (p < 0,05).
Data di pubblicazione: 13-03-2025