Le proteine DELLA sono maestri conservatiregolatori di crescitache svolgono un ruolo centrale nel controllo dello sviluppo delle piante in risposta a stimoli interni e ambientali. DELLA agisce come regolatore trascrizionale e viene reclutato sui promotori bersaglio legandosi ai fattori di trascrizione (TF) e all'istone H2A attraverso il suo dominio GRAS. Studi recenti hanno dimostrato che la stabilità di DELLA è regolata post-traduzionalmente attraverso due meccanismi: la poliubiquitinazione indotta dal fitormone gibberellina, che porta alla sua rapida degradazione, e la coniugazione di piccoli modificatori ubiquitin-like (SUMO) per aumentarne l'accumulo. Inoltre, l'attività di DELLA è regolata dinamicamente da due diverse glicosilazioni: l'interazione DELLA-TF è potenziata dalla O-fucosilazione ma inibita dalla modificazione della N-acetilglucosamina O-linked (O-GlcNAc). Tuttavia, il ruolo della fosforilazione di DELLA rimane poco chiaro, poiché studi precedenti hanno mostrato risultati contrastanti, che vanno da quelli che dimostrano che la fosforilazione promuove o riduce la degradazione di DELLA ad altri che dimostrano che la fosforilazione non ne influenza la stabilità. Qui identifichiamo i siti di fosforilazione in REPRESSORga1-3(RGA, AtDELLA) purificati da Arabidopsis thaliana mediante analisi di spettrometria di massa, dimostrano che la fosforilazione di due peptidi RGA nelle regioni PolyS e PolyS/T promuove il legame con H2A e aumenta l'attività di RGA. Associazione di RGA con i promotori target. In particolare, la fosforilazione non influenza le interazioni RGA-TF o la stabilità di RGA. Il nostro studio rivela il meccanismo molecolare attraverso il quale la fosforilazione induce l'attività di DELLA.
Per chiarire il ruolo della fosforilazione nella regolazione della funzione di DELLA, è fondamentale identificare i siti di fosforilazione di DELLA in vivo ed eseguire analisi funzionali nelle piante. Mediante purificazione per affinità di estratti vegetali seguita da analisi MS/MS, abbiamo identificato diversi fosfositi in RGA. In condizioni di carenza di GA, la fosforilazione di RHA aumenta, ma non ne compromette la stabilità. È importante sottolineare che i saggi di co-IP e ChIP-qPCR hanno rivelato che la fosforilazione nella regione PolyS/T di RGA promuove la sua interazione con H2A e la sua associazione con i promotori target, svelando il meccanismo con cui la fosforilazione induce la funzione di RGA.
RGA viene reclutato sulla cromatina bersaglio attraverso l'interazione del sottodominio LHR1 con il fattore di trascrizione (TF) e si lega quindi a H2A attraverso la sua regione PolyS/T e il sottodominio PFYRE, formando il complesso H2A-RGA-TF per stabilizzare RGA. La fosforilazione di Pep 2 nella regione PolyS/T tra il dominio DELLA e il dominio GRAS da parte di una chinasi non identificata migliora il legame RGA-H2A. La proteina mutante rgam2A abolisce la fosforilazione di RGA e adotta una diversa conformazione proteica per interferire con il legame a H2A. Ciò determina la destabilizzazione delle interazioni transitorie TF-rgam2A e la dissociazione di rgam2A dalla cromatina bersaglio. Questa figura illustra solo la repressione trascrizionale mediata da RGA. Un modello simile potrebbe essere descritto per l'attivazione trascrizionale mediata da RGA, con la differenza che il complesso H2A-RGA-TF promuoverebbe la trascrizione del gene bersaglio e la defosforilazione di rgam2A ne ridurrebbe la trascrizione. Figura modificata da Huang et al.21.
Tutti i dati quantitativi sono stati analizzati statisticamente utilizzando Excel e le differenze significative sono state determinate utilizzando il test t di Student. Non sono stati utilizzati metodi statistici per determinare preliminarmente la dimensione del campione. Nessun dato è stato escluso dall'analisi; l'esperimento non è stato randomizzato; i ricercatori non erano a conoscenza della distribuzione dei dati durante l'esperimento e della valutazione dei risultati. La dimensione del campione è indicata nella legenda delle figure e nel file dei dati sorgente.
Per maggiori informazioni sulla progettazione dello studio, consultare l'Abstract del Natural Portfolio Report associato a questo articolo.
I dati di proteomica ottenuti tramite spettrometria di massa sono stati forniti al consorzio ProteomeXchange tramite il repository del partner PRIDE66 con identificativo del dataset PXD046004. Tutti gli altri dati ottenuti durante questo studio sono presentati nelle Informazioni Supplementari, nei File di Dati Supplementari e nei File di Dati Grezzi. I dati sorgente sono forniti per questo articolo.
Data di pubblicazione: 08-11-2024