Le proteine DELLA sono conservateregolatori di crescitache svolgono un ruolo centrale nello sviluppo delle piante in risposta a segnali interni ed esterni. Come regolatori trascrizionali, le DELLA si legano ai fattori di trascrizione (TF) e all'istone H2A tramite i loro domini GRAS e vengono reclutate per agire sui promotori. Studi recenti hanno dimostrato che la stabilità delle DELLA è regolata post-traduzionalmente da due meccanismi: la poliubiquitinazione indotta dall'ormone vegetale.gibberellina, che porta alla loro rapida degradazione, e alla coniugazione con un piccolo modificatore ubiquitina-simile (SUMO), che ne aumenta l'accumulo. Inoltre, l'attività di DELLA è regolata dinamicamente da due distinti meccanismi di glicosilazione: la O-fucosilazione potenzia l'interazione DELLA-TF, mentre la modificazione della N-acetilglucosamina O-linked (O-GlcNAc) inibisce l'interazione DELLA-TF. Tuttavia, il ruolo della fosforilazione di DELLA non è chiaro, poiché studi precedenti hanno mostrato risultati contrastanti: alcuni suggeriscono che la fosforilazione promuova o reprima la degradazione di DELLA, mentre altri suggeriscono che la fosforilazione non ne influenzi la stabilità. In questo studio, identifichiamo i siti di fosforilazione nel repressore GA1-3 (RGA), AtDELLA, purificato da Arabidopsis thaliana mediante spettrometria di massa e dimostriamo che la fosforilazione di due peptidi RGA nelle regioni PolyS e PolyS/T potenzia l'attività di RGA promuovendo il legame con H2A e l'associazione di RGA con i promotori target. In particolare, la fosforilazione non ha influenzato le interazioni RGA-TF né la stabilità di RGA. Il nostro studio rivela un meccanismo molecolare attraverso il quale la fosforilazione induce l'attività di DELLA.
La nostra analisi spettrometrica di massa ha rivelato che sia Pep1 che Pep2 erano altamente fosforilati in RGA nel contesto di Ga1 deficitario di GA. Oltre a questo studio, studi fosfoproteomici hanno anche rivelato la fosforilazione di Pep1 in RGA, sebbene il suo ruolo non sia stato ancora studiato53,54,55. Al contrario, la fosforilazione di Pep2 non è stata precedentemente descritta poiché questo peptide poteva essere rilevato solo utilizzando il transgene RGAGKG. Sebbene la mutazione m1A, che ha abolito la fosforilazione di Pep1, abbia ridotto solo leggermente l'attività di RGA in planta, ha avuto un effetto additivo quando combinata con m2A nel ridurre l'attività di RGA (Figura supplementare 6). È importante notare che la fosforilazione di Pep1 è risultata significativamente ridotta nel mutante sly1 potenziato da GA rispetto a ga1, suggerendo che GA promuova la defosforilazione di RGA, riducendone l'attività. Il meccanismo con cui GA sopprime la fosforilazione di RGA richiede ulteriori studi. Una possibilità è che ciò sia ottenuto attraverso la regolazione di una protein chinasi non identificata. Sebbene studi abbiano dimostrato che l'espressione della protein chinasi CK1 EL1 sia sottoregolata da GA nel riso41, i nostri risultati indicano che mutazioni di ordine superiore dell'omologo di Arabidopsis EL1 (AEL1-4) non riducono la fosforilazione di RGA. In accordo con i nostri risultati, un recente studio fosfoproteomico che ha utilizzato linee di Arabidopsis sovraesprimenti AEL e un triplo mutante ael non ha identificato alcuna proteina DELLA come substrato di queste chinasi56. Quando abbiamo preparato il manoscritto, è stato riportato che GSK3, il gene che codifica una chinasi simile a GSK3/SHAGGY nel grano (Triticum aestivum), può fosforilare DELLA (Rht-B1b)57, sebbene la fosforilazione di Rht-B1b da parte di GSK3 non sia stata confermata in planta. Reazioni enzimatiche in vitro in presenza di GSK3, seguite da analisi di spettrometria di massa, hanno rivelato tre siti di fosforilazione situati tra i domini DELLA e GRAS di Rht-B1b (Figura 3 supplementare). Le sostituzioni da serina ad alanina in tutti e tre i siti di fosforilazione hanno determinato una riduzione dell'attività di Rht-B1b nel grano transgenico, in linea con i nostri risultati secondo cui le sostituzioni di alanina in Pep2 RGA diminuiscono l'attività di RGA. Tuttavia, saggi di degradazione proteica in vitro hanno ulteriormente dimostrato che la fosforilazione può anche stabilizzare Rht-B1b57. Ciò è in contrasto con i nostri risultati che mostrano che le sostituzioni di alanina in Pep2 RGA non alterano la sua stabilità in planta. GSK3 nel grano è un ortologo della proteina 2 insensibile ai brassinosteroidi (BIN2) in Arabidopsis 57. BIN2 è un regolatore negativo della segnalazione di BR, e BR attiva la sua via di segnalazione causando la degradazione di BIN2 58. Abbiamo dimostrato che il trattamento con BR non riduce la stabilità di RGA 59 o i livelli di fosforilazione in Arabidopsis (Figura supplementare 2), suggerendo che è improbabile che RGA venga fosforilata da BIN2.
Tutti i dati quantitativi sono stati analizzati statisticamente utilizzando Excel e le differenze significative sono state determinate utilizzando il test t di Student. Non sono stati utilizzati metodi statistici per predeterminare la dimensione del campione. Nessun dato è stato escluso dall'analisi; l'esperimento non è stato randomizzato; e i ricercatori erano a conoscenza dell'assegnazione durante l'esperimento e la valutazione dei risultati. Le dimensioni del campione sono indicate nelle didascalie delle figure e nei file dei dati grezzi.
Data di pubblicazione: 15 aprile 2025