Le proteine DELLA sono conservateregolatori della crescitache svolgono un ruolo centrale nello sviluppo delle piante in risposta a segnali interni ed esterni. Come regolatori trascrizionali, le DELLA si legano ai fattori di trascrizione (TF) e all'istone H2A tramite i loro domini GRAS e vengono reclutate per agire sui promotori. Studi recenti hanno dimostrato che la stabilità delle DELLA è regolata post-traduzionalmente da due meccanismi: la poliubiquitinazione indotta dall'ormone vegetalegibberellinache porta alla loro rapida degradazione e alla coniugazione con il piccolo modificatore simile all'ubiquitina (SUMO), che ne aumenta l'accumulo. Inoltre, l'attività DELLA è regolata dinamicamente da due distinti meccanismi di glicosilazione: l'O-fucosilazione potenzia l'interazione DELLA-TF, mentre la modificazione con N-acetilglucosammina O-legata (O-GlcNAc) inibisce l'interazione DELLA-TF. Tuttavia, il ruolo della fosforilazione DELLA non è chiaro, poiché studi precedenti hanno mostrato risultati contrastanti, con alcuni che suggeriscono che la fosforilazione promuova o reprima la degradazione di DELLA e altri che suggeriscono che la fosforilazione non influisca sulla loro stabilità. Qui, identifichiamo i siti di fosforilazione nel repressore GA1-3 (RGA), AtDELLA, purificato da Arabidopsis thaliana mediante spettrometria di massa e dimostriamo che la fosforilazione di due peptidi RGA nelle regioni PolyS e PolyS/T potenzia l'attività RGA promuovendo il legame con H2A e l'associazione di RGA con i promotori bersaglio. In particolare, la fosforilazione non ha influenzato le interazioni RGA-TF né la stabilità di RGA. Il nostro studio rivela un meccanismo molecolare attraverso il quale la fosforilazione induce l'attività della DELLA.
La nostra analisi mediante spettrometria di massa ha rivelato che sia Pep1 che Pep2 erano altamente fosforilati in RGA nel background Ga1 carente di GA. Oltre a questo studio, anche studi fosfoproteomici hanno rivelato la fosforilazione di Pep1 in RGA, sebbene il suo ruolo non sia stato ancora studiato53,54,55. Al contrario, la fosforilazione di Pep2 non era stata precedentemente descritta poiché questo peptide poteva essere rilevato solo utilizzando il transgene RGAGKG. Sebbene la mutazione m1A, che ha abolito la fosforilazione di Pep1, abbia ridotto solo leggermente l'attività di RGA in planta, ha avuto un effetto additivo se combinata con m2A nella riduzione dell'attività di RGA (Figura supplementare 6). È importante notare che la fosforilazione di Pep1 era significativamente ridotta nel mutante sly1 potenziato da GA rispetto a ga1, suggerendo che GA promuove la defosforilazione di RGA, riducendone l'attività. Il meccanismo con cui GA sopprime la fosforilazione di RGA richiede ulteriori indagini. Una possibilità è che ciò avvenga attraverso la regolazione di una proteina chinasi non identificata. Sebbene studi abbiano dimostrato che l'espressione della proteina chinasi CK1 EL1 è downregolata da GA nel riso41, i nostri risultati indicano che mutazioni di ordine superiore dell'omologo di Arabidopsis EL1 (AEL1-4) non riducono la fosforilazione di RGA. In accordo con i nostri risultati, un recente studio fosfoproteomico che ha utilizzato linee di Arabidopsis sovraesprimenti AEL e un triplo mutante ael non ha identificato alcuna proteina DELLA come substrato di queste chinasi56. Quando abbiamo preparato il manoscritto, è stato riportato che GSK3, il gene che codifica una chinasi simile a GSK3/SHAGGY nel grano (Triticum aestivum), può fosforilare DELLA (Rht-B1b)57, sebbene la fosforilazione di Rht-B1b da parte di GSK3 non sia stata confermata in planta. Le reazioni enzimatiche in vitro in presenza di GSK3, seguite da analisi mediante spettrometria di massa, hanno rivelato tre siti di fosforilazione situati tra i domini DELLA e GRAS di Rht-B1b (Figura supplementare 3). Le sostituzioni di serina con alanina in tutti e tre i siti di fosforilazione hanno determinato una diminuzione dell'attività di Rht-B1b nel grano transgenico, in linea con i nostri risultati che mostrano come le sostituzioni di alanina in Pep2 RGA riducano l'attività di RGA. Tuttavia, i test di degradazione proteica in vitro hanno ulteriormente dimostrato che la fosforilazione può anche stabilizzare Rht-B1b57. Ciò è in contrasto con i nostri risultati che mostrano come le sostituzioni di alanina in Pep2 RGA non ne alterino la stabilità nelle piante. La GSK3 nel grano è un ortologo della proteina 2 insensibile ai brassinosteroidi (BIN2) in Arabidopsis 57. BIN2 è un regolatore negativo della segnalazione BR e BR attiva la sua via di segnalazione causando la degradazione di BIN2 58. Abbiamo dimostrato che il trattamento con BR non riduce la stabilità di RGA 59 o i livelli di fosforilazione in Arabidopsis (Figura supplementare 2), suggerendo che è improbabile che RGA venga fosforilata da BIN2.
Tutti i dati quantitativi sono stati analizzati statisticamente utilizzando Excel e le differenze significative sono state determinate mediante il test t di Student. Non sono stati utilizzati metodi statistici per predeterminare la dimensione del campione. Nessun dato è stato escluso dall'analisi; l'esperimento non è stato randomizzato; e i ricercatori erano a conoscenza dell'assegnazione durante l'esperimento e la valutazione dei risultati. Le dimensioni del campione sono riportate nelle didascalie delle figure e nei file di dati grezzi.
Data di pubblicazione: 15-04-2025