La crescita del meristema apicale del germoglio (SAM) è fondamentale per l'architettura del fusto. Ormoni vegetaligibberellineLe gibberelline (GA) svolgono un ruolo chiave nel coordinamento della crescita delle piante, ma il loro ruolo nel meristema apicale del germoglio (SAM) rimane poco compreso. In questo studio, abbiamo sviluppato un biosensore ratiometrico per la segnalazione delle GA modificando la proteina DELLA in modo da sopprimere la sua essenziale funzione regolatrice nella risposta trascrizionale alle GA, preservandone al contempo la degradazione in seguito al riconoscimento delle GA. Dimostriamo che questo biosensore basato sulla degradazione registra accuratamente le variazioni dei livelli di GA e la percezione cellulare durante lo sviluppo. Abbiamo utilizzato questo biosensore per mappare l'attività di segnalazione delle GA nel SAM. Mostriamo che segnali elevati di GA sono presenti prevalentemente nelle cellule situate tra i primordi degli organi, che sono precursori delle cellule internodali. Utilizzando approcci di guadagno e perdita di funzione, dimostriamo inoltre che le GA regolano l'orientamento del piano di divisione cellulare, stabilendo l'organizzazione cellulare canonica degli internodi e promuovendo così la specificazione degli internodi nel SAM.
Il meristema apicale del germoglio (SAM), situato all'apice del germoglio, contiene una nicchia di cellule staminali la cui attività genera organi laterali e nodi del fusto in modo modulare e iterativo durante tutta la vita della pianta. Ciascuna di queste unità ripetitive, o nodi della pianta, comprende internodi e organi laterali a livello dei nodi, e meristemi ascellari nelle ascelle fogliari1. La crescita e l'organizzazione dei nodi della pianta cambiano durante lo sviluppo. In Arabidopsis, la crescita internodale è soppressa durante la fase vegetativa e i meristemi ascellari rimangono dormienti nelle ascelle delle foglie a rosetta. Durante la transizione alla fase floreale, il SAM diventa il meristema dell'infiorescenza, generando internodi allungati e gemme ascellari, rametti nelle ascelle delle foglie cauline e, successivamente, fiori senza foglie2. Sebbene siano stati compiuti progressi significativi nella comprensione dei meccanismi che controllano l'inizio della formazione di foglie, fiori e rami, si sa ancora relativamente poco su come si originano gli internodi.
Comprendere la distribuzione spazio-temporale delle GA aiuterà a comprendere meglio le funzioni di questi ormoni in diversi tessuti e in diverse fasi di sviluppo. La visualizzazione della degradazione della fusione RGA-GFP espressa sotto l'azione del proprio promotore fornisce informazioni importanti sulla regolazione dei livelli totali di GA nelle radici15,16. Tuttavia, l'espressione di RGA varia nei tessuti17 ed è regolata da GA18. Pertanto, l'espressione differenziale del promotore di RGA può determinare il pattern di fluorescenza osservato con RGA-GFP e quindi questo metodo non è quantitativo. Più recentemente, GA marcate con fluoresceina (Fl) bioattiva19,20 hanno rivelato l'accumulo di GA nell'endocorteccia radicale e la regolazione dei suoi livelli cellulari tramite il trasporto di GA. Recentemente, il sensore FRET di GA nlsGPS1 ha dimostrato che i livelli di GA sono correlati all'allungamento cellulare nelle radici, nei filamenti e negli ipocotili cresciuti al buio21. Tuttavia, come abbiamo visto, la concentrazione di GA non è l'unico parametro che controlla l'attività di segnalazione del GA, poiché dipende da complessi processi di rilevamento. In questo studio, basandoci sulla nostra comprensione delle vie di segnalazione DELLA e GA, presentiamo lo sviluppo e la caratterizzazione di un biosensore ratiometrico basato sulla degradazione per la segnalazione del GA. Per sviluppare questo biosensore quantitativo, abbiamo utilizzato una proteina RGA mutante sensibile al GA, fusa a una proteina fluorescente ed espressa ubiquitariamente nei tessuti, nonché una proteina fluorescente insensibile al GA. Dimostriamo che le fusioni proteiche con la proteina RGA mutante non interferiscono con la segnalazione endogena del GA quando espresse ubiquitariamente e che questo biosensore può quantificare l'attività di segnalazione derivante sia dall'input di GA sia dall'elaborazione del segnale del GA da parte dell'apparato di rilevamento con un'elevata risoluzione spazio-temporale. Abbiamo utilizzato questo biosensore per mappare la distribuzione spazio-temporale dell'attività di segnalazione del GA e quantificare come il GA regola il comportamento cellulare nell'epidermide SAM. Dimostriamo che l'GA regola l'orientamento del piano di divisione delle cellule SAM situate tra i primordi degli organi, definendo così l'organizzazione cellulare canonica dell'internodo.
Infine, ci siamo chiesti se qmRGA potesse segnalare i cambiamenti nei livelli endogeni di GA utilizzando gli ipocotili in crescita. In precedenza, abbiamo dimostrato che il nitrato stimola la crescita aumentando la sintesi di GA e, di conseguenza, la degradazione di DELLA34. Pertanto, abbiamo osservato che la lunghezza dell'ipocotile nelle plantule pUBQ10::qmRGA cresciute in presenza di un'abbondante fornitura di nitrato (10 mM NO3−) era significativamente maggiore rispetto a quella delle plantule cresciute in condizioni di carenza di nitrato (Figura supplementare 6a). In linea con la risposta di crescita, i segnali di GA erano più elevati negli ipocotili delle plantule cresciute in condizioni di 10 mM NO3− rispetto a quelle cresciute in assenza di nitrato (Figura supplementare 6b, c). Pertanto, qmRGA consente anche di monitorare i cambiamenti nella segnalazione di GA indotti da variazioni endogene nella concentrazione di GA.
Per comprendere se l'attività di segnalazione GA rilevata da qmRGA dipenda dalla concentrazione di GA e dalla percezione di GA, come previsto in base al design del sensore, abbiamo analizzato l'espressione dei tre recettori GID1 nei tessuti vegetativi e riproduttivi. Nelle plantule, la linea reporter GID1-GUS ha mostrato che GID1a e c erano altamente espressi nei cotiledoni (Fig. 3a-c). Inoltre, tutti e tre i recettori erano espressi nelle foglie, nei primordi delle radici laterali, negli apici radicali (ad eccezione della cuffia radicale di GID1b) e nel sistema vascolare (Fig. 3a-c). Nel meristema apicale del fusto (SAM) dell'infiorescenza, abbiamo rilevato segnali GUS solo per GID1b e 1c (Fig. supplementare 7a-c). L'ibridazione in situ ha confermato questi modelli di espressione e ha ulteriormente dimostrato che GID1c era uniformemente espresso a bassi livelli nel SAM, mentre GID1b mostrava un'espressione più elevata alla periferia del SAM (Fig. supplementare 7d-l). La fusione traslazionale pGID1b::2xmTQ2-GID1b ha inoltre rivelato una gamma graduale di espressione di GID1b, da bassa o nulla espressione al centro del SAM ad alta espressione ai bordi dell'organo (Figura supplementare 7m). Pertanto, i recettori GID1 non sono distribuiti uniformemente nei tessuti e al loro interno. In esperimenti successivi, abbiamo anche osservato che la sovraespressione di GID1 (pUBQ10::GID1a-mCherry) aumentava la sensibilità di qmRGA negli ipocotili all'applicazione esterna di GA (Figura 3d, e). Al contrario, la fluorescenza misurata da qd17mRGA nell'ipocotile era insensibile al trattamento con GA3 (Figura 3f, g). Per entrambi i test, le plantule sono state trattate con alte concentrazioni di GA (100 μM GA3) per valutare il comportamento rapido del sensore, in cui la capacità di legarsi al recettore GID1 veniva aumentata o persa. Nel complesso, questi risultati confermano che il biosensore qmRGA svolge una funzione combinata come sensore di GA e GA, e suggeriscono che l'espressione differenziale del recettore GID1 può modulare significativamente l'emissività del sensore.
Ad oggi, la distribuzione dei segnali GA nel SAM rimane poco chiara. Pertanto, abbiamo utilizzato piante che esprimono qmRGA e il reporter di cellule staminali pCLV3::mCherry-NLS35 per calcolare mappe quantitative ad alta risoluzione dell'attività di segnalazione GA, concentrandoci sullo strato L1 (epidermide; Fig. 4a, b, vedi Metodi e Metodi supplementari), poiché L1 svolge un ruolo chiave nel controllo della crescita del SAM36. In questo caso, l'espressione di pCLV3::mCherry-NLS ha fornito un punto di riferimento geometrico fisso per analizzare la distribuzione spazio-temporale dell'attività di segnalazione GA37. Sebbene GA sia considerato essenziale per lo sviluppo degli organi laterali4, abbiamo osservato che i segnali GA erano bassi nel primordio floreale (P) a partire dallo stadio P3 (Fig. 4a, b), mentre i giovani primordi P1 e P2 presentavano un'attività moderata simile a quella nella regione centrale (Fig. 4a, b). Un'attività di segnalazione GA più elevata è stata rilevata ai confini dei primordi degli organi, a partire da P1/P2 (ai lati del confine) e con un picco a P4, così come in tutte le cellule della regione periferica situata tra i primordi (Fig. 4a, b e Figura supplementare 8a, b). Questa attività di segnalazione GA più elevata è stata osservata non solo nell'epidermide ma anche negli strati L2 e L3 superiore (Figura supplementare 8b). Il modello dei segnali GA rilevati nel SAM utilizzando qmRGA è rimasto invariato nel tempo (Figura supplementare 8c-f, k). Sebbene il costrutto qd17mRGA fosse sistematicamente sottoregolato nel SAM delle piante T3 di cinque linee indipendenti che abbiamo caratterizzato in dettaglio, siamo stati in grado di analizzare i modelli di fluorescenza ottenuti con il costrutto pRPS5a::VENUS-2A-TagBFP (Figura supplementare 8g-j, l). In questa linea di controllo, sono state rilevate solo lievi variazioni nel rapporto di fluorescenza nel SAM, ma al centro del SAM abbiamo osservato una chiara e inaspettata diminuzione di VENUS associata a TagBFP. Ciò conferma che il modello di segnalazione osservato da qmRGA riflette la degradazione di mRGA-VENUS dipendente da GA, ma dimostra anche che qmRGA può sovrastimare l'attività di segnalazione di GA al centro del meristema. In sintesi, i nostri risultati rivelano un modello di segnalazione di GA che riflette principalmente la distribuzione dei primordi. Questa distribuzione della regione inter-primordiale (IPR) è dovuta al graduale instaurarsi di un'elevata attività di segnalazione di GA tra il primordio in via di sviluppo e la regione centrale, mentre allo stesso tempo l'attività di segnalazione di GA nel primordio diminuisce (Fig. 4c, d).
La distribuzione dei recettori GID1b e GID1c (vedi sopra) suggerisce che l'espressione differenziale dei recettori GA contribuisce a modellare il modello di attività di segnalazione GA nel SAM. Ci siamo chiesti se potesse essere coinvolto un accumulo differenziale di GA. Per indagare questa possibilità, abbiamo utilizzato il sensore FRET GA nlsGPS121. È stata rilevata una maggiore frequenza di attivazione nel SAM di nlsGPS1 trattato con 10 μM di GA4+7 per 100 min (Figura supplementare 9a-e), indicando che nlsGPS1 risponde ai cambiamenti nella concentrazione di GA nel SAM, come avviene nelle radici21. La distribuzione spaziale della frequenza di attivazione di nlsGPS1 ha rivelato livelli di GA relativamente bassi negli strati esterni del SAM, ma ha mostrato che erano elevati al centro e ai bordi del SAM (Figura 4e e Figura supplementare 9a,c). Ciò suggerisce che anche nel SAM il GA è distribuito con un modello spaziale paragonabile a quello rivelato da qmRGA. Come approccio complementare, abbiamo anche trattato il SAM con GA fluorescente (GA3-, GA4-, GA7-Fl) o con Fl da solo come controllo negativo. Il segnale Fl era distribuito in tutto il SAM, comprese la regione centrale e il primordio, sebbene con un'intensità inferiore (Fig. 4j e Figura supplementare 10d). Al contrario, tutti e tre i GA-Fl si sono accumulati specificamente entro i bordi del primordio e in misura variabile nel resto dell'IPR, con GA7-Fl che si è accumulato nel dominio più grande dell'IPR (Fig. 4k e Figura supplementare 10a,b). La quantificazione dell'intensità di fluorescenza ha rivelato che il rapporto di intensità IPR/non-IPR era più elevato nel SAM trattato con GA-Fl rispetto al SAM trattato con Fl (Fig. 4l e Figura supplementare 10c). Nel complesso, questi risultati suggeriscono che il GA è presente a concentrazioni più elevate nelle cellule dell'IPR che si trovano più vicine al bordo dell'organo. Ciò suggerisce che il modello di attività di segnalazione GA nel SAM derivi sia dall'espressione differenziale dei recettori GA sia dall'accumulo differenziale di GA nelle cellule IPR vicino ai confini degli organi. Pertanto, la nostra analisi ha rivelato un inatteso modello spazio-temporale di segnalazione GA, con minore attività nel centro e nel primordio del SAM e maggiore attività nell'IPR nella regione periferica.
Per comprendere il ruolo dell'attività differenziale di segnalazione GA nel SAM, abbiamo analizzato la correlazione tra l'attività di segnalazione GA, l'espansione cellulare e la divisione cellulare utilizzando l'imaging time-lapse in tempo reale del SAM qmRGA pCLV3::mCherry-NLS. Dato il ruolo di GA nella regolazione della crescita, ci si aspettava una correlazione positiva con i parametri di espansione cellulare. Pertanto, abbiamo prima confrontato le mappe dell'attività di segnalazione GA con le mappe del tasso di crescita della superficie cellulare (come proxy per la forza dell'espansione cellulare per una data cellula e per le cellule figlie in fase di divisione) e con le mappe dell'anisotropia di crescita, che misura la direzionalità dell'espansione cellulare (utilizzata anche qui per una data cellula e per le cellule figlie in fase di divisione; Fig. 5a,b, vedi Metodi e Metodi supplementari). Le nostre mappe del tasso di crescita della superficie cellulare del SAM sono coerenti con le osservazioni precedenti38,39, con tassi di crescita minimi al bordo e tassi di crescita massimi nei fiori in via di sviluppo (Fig. 5a). L'analisi delle componenti principali (PCA) ha mostrato che l'attività di segnalazione GA era correlata negativamente con l'intensità di crescita della superficie cellulare (Figura 5c). Abbiamo anche dimostrato che gli assi principali di variazione, inclusi l'input di segnalazione GA e l'intensità di crescita, erano ortogonali alla direzione determinata dall'elevata espressione di CLV3, confermando l'esclusione delle cellule dal centro SAM nelle analisi rimanenti. L'analisi di correlazione di Spearman ha confermato i risultati della PCA (Figura 5d), indicando che segnali GA più elevati nell'IPR non hanno portato a una maggiore espansione cellulare. Tuttavia, l'analisi di correlazione ha rivelato una leggera correlazione positiva tra l'attività di segnalazione GA e l'anisotropia di crescita (Figura 5c, d), suggerendo che una segnalazione GA più elevata nell'IPR influenza la direzione della crescita cellulare e possibilmente la posizione del piano di divisione cellulare.
a, b Mappe di calore della crescita superficiale media (a) e dell'anisotropia di crescita (b) nel SAM, mediate su sette piante indipendenti (utilizzate rispettivamente come proxy per la forza e la direzione dell'espansione cellulare). c L'analisi PCA includeva le seguenti variabili: segnale GA, intensità di crescita superficiale, anisotropia di crescita superficiale ed espressione di CLV3. La componente 1 della PCA era principalmente correlata negativamente con l'intensità di crescita superficiale e positivamente con il segnale GA. La componente 2 della PCA era principalmente correlata positivamente con l'anisotropia di crescita superficiale e negativamente con l'espressione di CLV3. Le percentuali rappresentano la variazione spiegata da ciascuna componente. d Analisi di correlazione di Spearman tra segnale GA, intensità di crescita superficiale e anisotropia di crescita superficiale a livello tissutale, escludendo la CZ. Il numero a destra è il valore rho di Spearman tra due variabili. Gli asterischi indicano i casi in cui la correlazione/correlazione negativa è altamente significativa. e Visualizzazione 3D delle cellule L1 del SAM di Col-0 mediante microscopia confocale. Le nuove pareti cellulari formate nel SAM (ma non nel primordio) a 10 h sono colorate in base ai loro valori angolari. La barra dei colori è mostrata nell'angolo in basso a destra. L'inserto mostra la corrispondente immagine 3D a 0 h. L'esperimento è stato ripetuto due volte con risultati simili. f I box plot mostrano i tassi di divisione cellulare nel SAM di Col-0 IPR e non-IPR (n = 10 piante indipendenti). La linea centrale mostra la mediana e i bordi del box indicano il 25° e il 75° percentile. I baffi indicano i valori minimi e massimi determinati con il software R. I valori P sono stati ottenuti con il test t a due code di Welch. g, h Diagramma schematico che mostra (g) come misurare l'angolo della nuova parete cellulare (magenta) rispetto alla direzione radiale dal centro del SAM (linea tratteggiata bianca) (vengono considerati solo i valori angolari acuti, cioè 0–90°), e (h) le direzioni circonferenziale/laterale e radiale all'interno del meristema. i Istogrammi di frequenza dell'orientamento del piano di divisione cellulare attraverso il SAM (blu scuro), l'IPR (blu medio) e il non-IPR (blu chiaro), rispettivamente. I valori P sono stati ottenuti mediante un test di Kolmogorov-Smirnov a due code. L'esperimento è stato ripetuto due volte con risultati simili. j Istogrammi di frequenza dell'orientamento del piano di divisione cellulare dell'IPR attorno a P3 (verde chiaro), P4 (verde medio) e P5 (verde scuro), rispettivamente. I valori P sono stati ottenuti mediante un test di Kolmogorov-Smirnov a due code. L'esperimento è stato ripetuto due volte con risultati simili.
Pertanto, abbiamo successivamente studiato la correlazione tra la segnalazione GA e l'attività di divisione cellulare identificando le pareti cellulari di nuova formazione durante il test (Fig. 5e). Questo approccio ci ha permesso di misurare la frequenza e la direzione della divisione cellulare. Sorprendentemente, abbiamo scoperto che la frequenza delle divisioni cellulari nell'IPR e nel resto del SAM (non-IPR, Fig. 5f) era simile, indicando che le differenze nella segnalazione GA tra le cellule IPR e non-IPR non influenzano significativamente la divisione cellulare. Questo, e la correlazione positiva tra la segnalazione GA e l'anisotropia di crescita, ci hanno spinto a considerare se l'attività di segnalazione GA potesse influenzare l'orientamento del piano di divisione cellulare. Abbiamo misurato l'orientamento della nuova parete cellulare come un angolo acuto rispetto all'asse radiale che collega il centro del meristema e il centro della nuova parete cellulare (Fig. 5e-i) e abbiamo osservato una chiara tendenza delle cellule a dividersi ad angoli prossimi a 90° rispetto all'asse radiale, con le frequenze più elevate osservate a 70–80° (23,28%) e 80–90° (22,62%) (Fig. 5e,i), corrispondenti a divisioni cellulari in direzione circonferenziale/trasversale (Fig. 5h). Per esaminare il contributo della segnalazione GA a questo comportamento di divisione cellulare, abbiamo analizzato separatamente i parametri di divisione cellulare nell'IPR e nel non-IPR (Fig. 5i). Abbiamo osservato che la distribuzione dell'angolo di divisione nelle cellule IPR differiva da quella nelle cellule non-IPR o nelle cellule dell'intero SAM, con le cellule IPR che mostravano una proporzione maggiore di divisioni cellulari laterali/circolari, ovvero 70–80° e 80–90° (33,86% e 30,71%, rispettivamente, proporzioni corrispondenti) (Fig. 5i). Pertanto, le nostre osservazioni hanno rivelato un'associazione tra un'elevata segnalazione GA e un orientamento del piano di divisione cellulare vicino alla direzione circonferenziale, simile alla correlazione tra l'attività di segnalazione GA e l'anisotropia di crescita (Fig. 5c, d). Per stabilire ulteriormente la conservazione spaziale di questa associazione, abbiamo misurato l'orientamento del piano di divisione nelle cellule IPR che circondano il primordio a partire da P3, poiché la più alta attività di segnalazione GA è stata rilevata in questa regione a partire da P4 (Fig. 4). Gli angoli di divisione dell'IPR intorno a P3 e P4 non hanno mostrato differenze statisticamente significative, sebbene sia stata osservata una maggiore frequenza di divisioni cellulari laterali nell'IPR intorno a P4 (Fig. 5j). Tuttavia, nelle cellule dell'IPR intorno a P5, la differenza nell'orientamento del piano di divisione cellulare è diventata statisticamente significativa, con un netto aumento della frequenza di divisioni cellulari trasversali (Fig. 5j). Nel complesso, questi risultati suggeriscono che la segnalazione GA può controllare l'orientamento delle divisioni cellulari nel SAM, il che è coerente con precedenti studi40,41 secondo i quali un'elevata segnalazione GA può indurre l'orientamento laterale delle divisioni cellulari nell'IPR.
Si prevede che le cellule nell'IPR non vengano incorporate nei primordi, bensì negli internodi2,42,43. L'orientamento trasversale delle divisioni cellulari nell'IPR può determinare la tipica organizzazione di file longitudinali parallele di cellule epidermiche negli internodi. Le nostre osservazioni sopra descritte suggeriscono che la segnalazione delle gibberelline (GA) probabilmente svolga un ruolo in questo processo, regolando la direzione della divisione cellulare.
La perdita di funzione di diversi geni DELLA determina una risposta costitutiva alle GA, e i mutanti della possono essere utilizzati per testare questa ipotesi44. Abbiamo innanzitutto analizzato i modelli di espressione di cinque geni DELLA nel SAM. La fusione trascrizionale della linea GUS45 ha rivelato che GAI, RGA, RGL1 e RGL2 (in misura molto minore) erano espressi nel SAM (Figura supplementare 11a-d). L'ibridazione in situ ha inoltre dimostrato che l'mRNA di GAI si accumula specificamente nei primordi e nei fiori in via di sviluppo (Figura supplementare 11e). L'mRNA di RGL1 e RGL3 è stato rilevato in tutta la chioma del SAM e nei fiori più vecchi, mentre l'mRNA di RGL2 era più abbondante nella regione di confine (Figura supplementare 11f-h). L'imaging confocale del SAM di pRGL3::RGL3-GFP ha confermato l'espressione osservata mediante ibridazione in situ e ha mostrato che la proteina RGL3 si accumula nella parte centrale del SAM (Figura supplementare 11i). Utilizzando la linea pRGA::GFP-RGA, abbiamo anche scoperto che la proteina RGA si accumula nel SAM, ma la sua abbondanza diminuisce al confine a partire da P4 (Figura supplementare 11j). In particolare, i modelli di espressione di RGL3 e RGA sono coerenti con una maggiore attività di segnalazione GA nell'IPR, come rilevato da qmRGA (Figura 4). Inoltre, questi dati indicano che tutte le proteine DELLA sono espresse nel SAM e che la loro espressione collettiva si estende all'intero SAM.
Abbiamo quindi analizzato i parametri di divisione cellulare nel SAM di tipo selvatico (Ler, controllo) e nei mutanti quintuplo (globali) gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 della (Fig. 6a, b). È interessante notare che abbiamo osservato uno spostamento statisticamente significativo nella distribuzione delle frequenze dell'angolo di divisione cellulare nel SAM mutante della globale rispetto al tipo selvatico (Fig. 6c). Questo cambiamento nel mutante della globale era dovuto a un aumento della frequenza degli angoli di 80–90° (34,71% contro 24,55%) e, in misura minore, degli angoli di 70–80° (23,78% contro 20,18%), ovvero corrispondenti alle divisioni cellulari trasversali (Fig. 6c). Anche la frequenza delle divisioni non trasversali (0–60°) era inferiore nel mutante della globale (Fig. 6c). La frequenza delle divisioni cellulari trasversali è risultata significativamente aumentata nel SAM del mutante della global (Fig. 6b). Anche la frequenza delle divisioni cellulari trasversali nell'IPR è risultata più elevata nel mutante della global rispetto al tipo selvatico (Fig. 6d). Al di fuori della regione IPR, il tipo selvatico presentava una distribuzione più uniforme degli angoli di divisione cellulare, mentre il mutante della global prediligeva divisioni tangenziali simili a quelle dell'IPR (Fig. 6e). Abbiamo inoltre quantificato l'orientamento delle divisioni cellulari nel SAM dei mutanti quintupli della ga2 ossidasi (ga2ox) (ga2ox1-1, ga2ox2-1, ga2ox3-1, ga2ox4-1 e ga2ox6-2), un background mutante inattivo per la GA in cui la GA si accumula. In linea con l'aumento dei livelli di GA, il SAM dell'infiorescenza del mutante quintuplo ga2ox era più grande di quello di Col-0 (Figura supplementare 12a, b) e, rispetto a Col-0, il SAM del mutante quintuplo ga2ox mostrava una distribuzione nettamente diversa degli angoli di divisione cellulare, con la frequenza dell'angolo che aumentava da 50° a 90°, favorendo quindi nuovamente le divisioni tangenziali (Figura supplementare 12a-c). Pertanto, dimostriamo che l'attivazione costitutiva della segnalazione di GA e l'accumulo di GA inducono divisioni cellulari laterali nell'IPR e nel resto del SAM.
a, b Visualizzazione 3D dello strato L1 del SAM di Ler colorato con PI (a) e del mutante globale della (b) mediante microscopia confocale. Le nuove pareti cellulari formate nel SAM (ma non nel primordio) in un periodo di 10 ore sono mostrate e colorate in base ai loro valori angolari. L'inserto mostra il SAM a 0 ore. La barra dei colori è visualizzata nell'angolo in basso a destra. La freccia in (b) indica un esempio di file di cellule allineate nel mutante globale della. L'esperimento è stato ripetuto due volte con risultati simili. c Confronto della distribuzione di frequenza degli orientamenti del piano di divisione cellulare nell'intero SAM (d), IPR (e) e non-IPR (f) tra Ler e globale della. I valori P sono stati ottenuti utilizzando un test di Kolmogorov-Smirnov a due code. f, g Visualizzazione 3D di immagini confocali del SAM colorato con PI di piante transgeniche Col-0 (i) e pCUC2::gai-1-VENUS (j). I pannelli (a, b) mostrano nuove pareti cellulari (ma non primordi) formate nel SAM entro 10 ore. L'esperimento è stato ripetuto due volte con risultati simili. h–j Confronto della distribuzione di frequenza degli orientamenti del piano di divisione cellulare situati nell'intero SAM (h), IPR (i) e non-IPR (j) tra le piante Col-0 e pCUC2::gai-1-VENUS. I valori P sono stati ottenuti utilizzando un test di Kolmogorov-Smirnov a due code.
Abbiamo quindi testato l'effetto dell'inibizione della segnalazione GA specificamente nell'IPR. A tal fine, abbiamo utilizzato il promotore della coppa cotiledonare 2 (CUC2) per guidare l'espressione di una proteina gai-1 dominante negativa fusa a VENUS (nella linea pCUC2::gai-1-VENUS). Nel SAM di tipo selvatico, il promotore CUC2 guida l'espressione della maggior parte degli IPR nel SAM, comprese le cellule di confine, a partire da P4, e un'espressione specifica simile è stata osservata nelle piante pCUC2::gai-1-VENUS (vedi sotto). La distribuzione degli angoli di divisione cellulare attraverso il SAM o l'IPR delle piante pCUC2::gai-1-VENUS non era significativamente diversa da quella del tipo selvatico, sebbene inaspettatamente abbiamo scoperto che le cellule senza IPR in queste piante si dividevano con una frequenza più alta di 80-90° (Fig. 6f-j).
È stato suggerito che la direzione della divisione cellulare dipenda dalla geometria del SAM, in particolare dallo stress di trazione generato dalla curvatura del tessuto46. Abbiamo quindi chiesto se la forma del SAM fosse alterata nelle piante mutanti della global e pCUC2::gai-1-VENUS. Come riportato in precedenza12, le dimensioni del SAM del mutante della global erano maggiori di quelle del tipo selvatico (Figura supplementare 13a, b, d). L'ibridazione in situ di CLV3 e RNA STM ha confermato l'espansione del meristema nei mutanti della e ha inoltre mostrato l'espansione laterale della nicchia delle cellule staminali (Figura supplementare 13e, f, h, i). Tuttavia, la curvatura del SAM era simile in entrambi i genotipi (Figura supplementare 13k, m, n, p). Abbiamo osservato un aumento di dimensioni simile nel mutante quadruplo della gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 senza un cambiamento nella curvatura rispetto al tipo selvatico (Figura supplementare 13c, d, g, j, l, o, p). Anche la frequenza dell'orientamento della divisione cellulare è risultata alterata nel mutante quadruplo della, ma in misura minore rispetto al mutante monolitico della (Figura supplementare 12d-f). Questo effetto di dosaggio, insieme alla mancanza di un effetto sulla curvatura, suggerisce che l'attività residua di RGL3 nel mutante quadruplo Della limiti i cambiamenti nell'orientamento della divisione cellulare causati dalla perdita dell'attività di DELLA e che i cambiamenti nelle divisioni cellulari laterali si verifichino in risposta a cambiamenti nell'attività di segnalazione di GA piuttosto che a cambiamenti nella geometria del SAM. Come descritto in precedenza, il promotore CUC2 guida l'espressione di IPR nel SAM a partire da P4 (Figura supplementare 14a, b) e, al contrario, il SAM di pCUC2::gai-1-VENUS presentava dimensioni ridotte ma una curvatura maggiore (Figura supplementare 14c-h). Questo cambiamento nella morfologia del SAM di pCUC2::gai-1-VENUS potrebbe comportare una diversa distribuzione delle sollecitazioni meccaniche rispetto al tipo selvatico, in cui elevate sollecitazioni circonferenziali iniziano a una distanza minore dal centro del SAM47. In alternativa, i cambiamenti nella morfologia del SAM di pCUC2::gai-1-VENUS potrebbero derivare da cambiamenti nelle proprietà meccaniche regionali indotti dall'espressione del transgene48. In entrambi i casi, ciò potrebbe compensare parzialmente gli effetti dei cambiamenti nella segnalazione GA aumentando la probabilità che le cellule si dividano in orientamento circonferenziale/trasversale, spiegando le nostre osservazioni.
Nel complesso, i nostri dati confermano che una maggiore segnalazione di GA svolge un ruolo attivo nell'orientamento laterale del piano di divisione cellulare nell'IPR. Essi dimostrano inoltre che anche la curvatura del meristema influenza l'orientamento del piano di divisione cellulare nell'IPR.
L'orientamento trasversale del piano di divisione nell'IPR, dovuto all'elevata attività di segnalazione GA, suggerisce che la GA pre-organizza una fila di cellule radiali nell'epidermide all'interno del SAM per definire l'organizzazione cellulare che si troverà successivamente nell'internodo epidermico. Infatti, tali file di cellule erano frequentemente visibili nelle immagini del SAM dei mutanti della global (Fig. 6b). Pertanto, per esplorare ulteriormente la funzione di sviluppo del modello spaziale di segnalazione GA nel SAM, abbiamo utilizzato l'imaging time-lapse per analizzare l'organizzazione spaziale delle cellule nell'IPR in piante selvatiche (Ler e Col-0), mutanti della global e piante transgeniche pCUC2::gai-1-VENUS.
Abbiamo scoperto che qmRGA mostrava che l'attività di segnalazione GA nell'IPR aumentava da P1/P2 e raggiungeva il picco a P4, e questo schema rimaneva costante nel tempo (Fig. 4a-f e Fig. supplementare 8c-f, k). Per analizzare l'organizzazione spaziale delle cellule nell'IPR con l'aumento del segnale GA, abbiamo etichettato le cellule IPR Ler sopra e ai lati di P4 in base al loro destino di sviluppo analizzato 34 ore dopo la prima osservazione, ovvero più di due tempi plastidiali, permettendoci di seguire le cellule IPR durante lo sviluppo del primordio da P1/P2 a P4. Abbiamo usato tre colori diversi: giallo per le cellule che erano integrate nel primordio vicino a P4, verde per quelle che erano nell'IPR e viola per quelle che partecipavano a entrambi i processi (Fig. 7a-c). A t0 (0 h), 1-2 strati di cellule IPR erano visibili davanti a P4 (Fig. 7a). Come previsto, quando queste cellule si dividevano, lo facevano principalmente attraverso il piano di divisione trasversale (Figg. 7a–c). Risultati simili sono stati ottenuti utilizzando il SAM di Col-0 (concentrandosi su P3, il cui bordo si piega in modo simile a P4 in Ler), sebbene in questo genotipo la piega formata al bordo floreale nascondesse più rapidamente le cellule IPR (Fig. 7g–i). Pertanto, il modello di divisione delle cellule IPR pre-organizza le cellule in file radiali, come negli internodi. L'organizzazione in file radiali e la localizzazione delle cellule IPR tra organi successivi suggeriscono che queste cellule siano progenitori internodali.
In questo studio, abbiamo sviluppato un biosensore ratiometrico per la segnalazione delle gibberelline (GA), denominato qmRGA, che consente la mappatura quantitativa dell'attività di segnalazione delle GA derivante dalla combinazione delle concentrazioni di GA e del suo recettore, minimizzando al contempo le interferenze con le vie di segnalazione endogene e fornendo così informazioni sulla funzione delle GA a livello cellulare. A tal fine, abbiamo costruito una proteina DELLA modificata, mRGA, che ha perso la capacità di legarsi ai partner di interazione della DELLA, ma rimane sensibile alla proteolisi indotta dalle GA. qmRGA risponde sia a variazioni esogene che endogene dei livelli di GA e le sue proprietà di rilevamento dinamico consentono la valutazione delle variazioni spazio-temporali dell'attività di segnalazione delle GA durante lo sviluppo. qmRGA è inoltre uno strumento molto flessibile, in quanto può essere adattato a diversi tessuti modificando il promotore utilizzato per la sua espressione (se necessario) e, data la natura conservata della via di segnalazione delle GA e del motivo PFYRE nelle angiosperme, è probabile che sia trasferibile ad altre specie22. In linea con ciò, è stato dimostrato che una mutazione equivalente nella proteina DELLA SLR1 del riso (HYY497AAA) sopprime l'attività di repressore della crescita di SLR1, riducendo solo leggermente la sua degradazione mediata da GA, in modo simile a mRGA23. In particolare, recenti studi su Arabidopsis hanno dimostrato che una singola mutazione aminoacidica nel dominio PFYRE (S474L) altera l'attività trascrizionale di RGA senza influenzarne la capacità di interagire con i partner dei fattori di trascrizione50. Sebbene questa mutazione sia molto vicina alle 3 sostituzioni aminoacidiche presenti in mRGA, i nostri studi dimostrano che queste due mutazioni alterano caratteristiche distinte di DELLA. Sebbene la maggior parte dei partner dei fattori di trascrizione si leghi ai domini LHR1 e SAW di DELLA26,51, alcuni aminoacidi conservati nel dominio PFYRE potrebbero contribuire a stabilizzare queste interazioni.
Lo sviluppo degli internodi è un tratto chiave nell'architettura delle piante e nel miglioramento della resa. qmRGA ha rivelato una maggiore attività di segnalazione GA nelle cellule progenitrici degli internodi IPR. Combinando l'imaging quantitativo e la genetica, abbiamo dimostrato che i modelli di segnalazione GA sovrappongono piani di divisione cellulare circolari/trasversali nell'epidermide SAM, modellando l'organizzazione della divisione cellulare necessaria per lo sviluppo degli internodi. Diversi regolatori dell'orientamento del piano di divisione cellulare sono stati identificati durante lo sviluppo52,53. Il nostro lavoro fornisce un chiaro esempio di come l'attività di segnalazione GA regoli questo parametro cellulare. DELLA può interagire con i complessi proteici di pre-ripiegamento41, quindi la segnalazione GA può regolare l'orientamento del piano di divisione cellulare influenzando direttamente l'orientamento dei microtubuli corticali40,41,54,55. Abbiamo inaspettatamente dimostrato che nel SAM, il correlato di una maggiore attività di segnalazione GA non era l'allungamento o la divisione cellulare, ma solo l'anisotropia della crescita, il che è coerente con un effetto diretto di GA sulla direzione della divisione cellulare nell'IPR. Tuttavia, non possiamo escludere che questo effetto possa essere anche indiretto, ad esempio mediato dall'ammorbidimento della parete cellulare indotto da GA56. I cambiamenti nelle proprietà della parete cellulare inducono stress meccanico57,58, che può anche influenzare l'orientamento del piano di divisione cellulare influenzando l'orientamento dei microtubuli corticali39,46,59. Gli effetti combinati dello stress meccanico indotto da GA e della regolazione diretta dell'orientamento dei microtubuli da parte di GA potrebbero essere coinvolti nella generazione di uno specifico modello di orientamento della divisione cellulare nell'IPR per definire gli internodi, e sono necessari ulteriori studi per verificare questa ipotesi. Allo stesso modo, studi precedenti hanno evidenziato l'importanza delle proteine interagenti con DELLA TCP14 e 15 nel controllo della formazione degli internodi60,61 e questi fattori potrebbero mediare l'azione di GA insieme a BREVIPEDICELLUS (BP) e PENNYWISE (PNY), che regolano lo sviluppo degli internodi e hanno dimostrato di influenzare la segnalazione di GA2,62. Dato che le proteine DELLA interagiscono con le vie di segnalazione dei brassinosteroidi, dell'etilene, dell'acido jasmonico e dell'acido abscissico (ABA)63,64 e che questi ormoni possono influenzare l'orientamento dei microtubuli65, gli effetti delle GA sull'orientamento della divisione cellulare potrebbero essere mediati anche da altri ormoni.
Studi citologici preliminari hanno dimostrato che sia la regione interna che quella esterna del meristema apicale del fusto (SAM) di Arabidopsis sono necessarie per lo sviluppo degli internodi2,42. Il fatto che l'acido gibberellico (GA) regoli attivamente la divisione cellulare nei tessuti interni12 supporta una duplice funzione del GA nella regolazione delle dimensioni del meristema e degli internodi nel SAM. Anche il modello di divisione cellulare direzionale è strettamente regolato nel tessuto interno del SAM, e questa regolazione è essenziale per la crescita del fusto52. Sarà interessante esaminare se il GA svolga anche un ruolo nell'orientamento del piano di divisione cellulare nell'organizzazione interna del SAM, sincronizzando così la specificazione e lo sviluppo degli internodi all'interno del SAM.
Le piante sono state coltivate in vitro in terreno o in terreno Murashige-Skoog (MS) 1x (Duchefa) supplementato con saccarosio all'1% e agar all'1% (Sigma) in condizioni standard (16 ore di luce, 22 °C), ad eccezione degli esperimenti sulla crescita dell'ipocotile e delle radici, nei quali le piantine sono state coltivate su piastre verticali in condizioni di luce costante e a 22 °C. Per gli esperimenti con i nitrati, le piante sono state coltivate su terreno MS modificato (terreno vegetale bioWORLD) supplementato con nitrati in quantità adeguata (0 o 10 mM KNO3), 0,5 mM NH4-succinato, saccarosio all'1% e agar A all'1% (Sigma) in condizioni di fotoperiodo lungo.
Il cDNA di GID1a inserito in pDONR221 è stato ricombinato con pDONR P4-P1R-pUBQ10 e pDONR P2R-P3-mCherry in pB7m34GW per generare pUBQ10::GID1a-mCherry. Il DNA di IDD2 inserito in pDONR221 è stato ricombinato in pB7RWG266 per generare p35S:IDD2-RFP. Per generare pGID1b::2xmTQ2-GID1b, un frammento di 3,9 kb a monte della regione codificante di GID1b e un frammento di 4,7 kb contenente il cDNA di GID1b (1,3 kb) e il terminatore (3,4 kb) sono stati prima amplificati utilizzando i primer nella Tabella supplementare 3 e poi inseriti rispettivamente in pDONR P4-P1R (Thermo Fisher Scientific) e pDONR P2R-P3 (Thermo Fisher Scientific), e infine ricombinati con pDONR221 2xmTQ268 nel vettore target pGreen 012567 utilizzando il clonaggio Gateway. Per generare pCUC2::LSSmOrange, la sequenza del promotore CUC2 (3229 bp a monte di ATG) seguita dalla sequenza codificante di un grande mOrange con spostamento di Stokes (LSSmOrange)69 con il segnale di localizzazione nucleare N7 e il terminatore trascrizionale NOS sono stati assemblati nel vettore di targeting per la kanamicina pGreen utilizzando il sistema di ricombinazione a 3 frammenti Gateway (Invitrogen). Il vettore binario vegetale è stato introdotto nel ceppo GV3101 di Agrobacterium tumefaciens e nelle foglie di Nicotiana benthamiana mediante il metodo di infiltrazione di Agrobacterium e in Arabidopsis thaliana Col-0 mediante il metodo di immersione floreale, rispettivamente. pUBQ10::qmRGA pUBQ10::GID1a-mCherry e pCLV3::mCherry-NLS qmRGA sono stati isolati rispettivamente dalle progenie F3 e F1 dei rispettivi incroci.
L'ibridazione in situ dell'RNA è stata eseguita su punte di germogli lunghe circa 1 cm72, che sono state raccolte e immediatamente fissate in soluzione FAA (formaldeide al 3,7%, acido acetico al 5%, etanolo al 50%) preraffreddata a 4 °C. Dopo 2 trattamenti sottovuoto di 15 minuti ciascuno, il fissativo è stato cambiato e i campioni sono stati incubati per una notte. I cDNA di GID1a, GID1b, GID1c, GAI, RGL1, RGL2 e RGL3 e le sonde antisenso per le loro regioni 3′-UTR sono stati sintetizzati utilizzando i primer mostrati nella Tabella supplementare 3 come descritto da Rosier et al.73. Le sonde marcate con digossigenina sono state immunorilevate utilizzando anticorpi anti-digossigenina (diluizione 3000 volte; Roche, numero di catalogo: 11 093 274 910) e le sezioni sono state colorate con una soluzione di 5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato (BCIP, diluizione 250 volte)/nitroblu tetrazolio (NBT, diluizione 200 volte).
Data di pubblicazione: 10 febbraio 2025