La crescita del meristema apicale del germoglio (SAM) è fondamentale per l'architettura del fusto. Ormoni vegetaligibberellineGli GA svolgono un ruolo chiave nel coordinamento della crescita vegetale, ma il loro ruolo nel SAM rimane poco compreso. In questo studio, abbiamo sviluppato un biosensore ratiometrico della segnalazione degli GA ingegnerizzando la proteina DELLA per sopprimerne la funzione regolatrice essenziale nella risposta trascrizionale degli GA, preservandone al contempo la degradazione in seguito al riconoscimento degli GA. Dimostriamo che questo biosensore basato sulla degradazione registra accuratamente le variazioni dei livelli di GA e del rilevamento cellulare durante lo sviluppo. Abbiamo utilizzato questo biosensore per mappare l'attività di segnalazione degli GA nel SAM. Dimostriamo che elevati segnali di GA sono presenti prevalentemente nelle cellule situate tra i primordi degli organi, che sono precursori delle cellule internodali. Utilizzando approcci di guadagno e perdita di funzione, dimostriamo inoltre che gli GA regolano l'orientamento del piano di divisione cellulare, stabilendo l'organizzazione cellulare canonica degli internodi e promuovendo così la specificazione degli internodi nel SAM.
Il meristema apicale del germoglio (SAM), situato all'apice del germoglio, contiene una nicchia di cellule staminali la cui attività genera organi laterali e nodi staminali in modo modulare e iterativo per tutta la vita della pianta. Ciascuna di queste unità ripetitive, o nodi vegetali, include internodi e organi laterali ai nodi, e meristemi ascellari nelle ascelle fogliari1. La crescita e l'organizzazione dei nodi vegetali cambiano durante lo sviluppo. In Arabidopsis, la crescita internodale è soppressa durante la fase vegetativa e i meristemi ascellari rimangono dormienti nelle ascelle delle foglie a rosetta. Durante la transizione alla fase floreale, il SAM diventa il meristema dell'infiorescenza, generando internodi allungati e gemme ascellari, rametti nelle ascelle delle foglie cauline e, successivamente, fiori senza foglie2. Sebbene abbiamo compiuto progressi significativi nella comprensione dei meccanismi che controllano l'inizio di foglie, fiori e rami, si sa relativamente poco su come si formano gli internodi.
La comprensione della distribuzione spaziotemporale degli GA aiuterà a comprendere meglio le funzioni di questi ormoni in diversi tessuti e in diverse fasi dello sviluppo. La visualizzazione della degradazione della fusione RGA-GFP espressa sotto l'azione del proprio promotore fornisce informazioni importanti sulla regolazione dei livelli totali di GA nelle radici15,16. Tuttavia, l'espressione di RGA varia nei tessuti17 ed è regolata da GA18. Pertanto, l'espressione differenziale del promotore di RGA può determinare il pattern di fluorescenza osservato con RGA-GFP e quindi questo metodo non è quantitativo. Più recentemente, GA marcata con fluoresceina bioattiva (Fl)19,20 ha rivelato l'accumulo di GA nell'endocorteccia radicale e la regolazione dei suoi livelli cellulari tramite il trasporto di GA. Recentemente, il sensore FRET nlsGPS1 per GA ha mostrato che i livelli di GA sono correlati con l'allungamento cellulare in radici, filamenti e ipocotili cresciuti al buio21. Tuttavia, come abbiamo visto, la concentrazione di GA non è l'unico parametro che controlla l'attività di segnalazione di GA, poiché dipende da complessi processi di rilevamento. In questo articolo, basandoci sulla nostra comprensione delle vie di segnalazione di DELLA e GA, riportiamo lo sviluppo e la caratterizzazione di un biosensore ratiometrico basato sulla degradazione per la segnalazione di GA. Per sviluppare questo biosensore quantitativo, abbiamo utilizzato una RGA mutante sensibile a GA, fusa a una proteina fluorescente ed espressa ubiquitariamente nei tessuti, nonché una proteina fluorescente insensibile a GA. Dimostriamo che le fusioni proteiche di RGA mutante non interferiscono con la segnalazione endogena di GA quando espressa ubiquitariamente, e che questo biosensore può quantificare l'attività di segnalazione risultante sia dall'input di GA che dall'elaborazione del segnale di GA da parte dell'apparato di rilevamento con elevata risoluzione spaziotemporale. Abbiamo utilizzato questo biosensore per mappare la distribuzione spaziotemporale dell'attività di segnalazione di GA e quantificare come GA regoli il comportamento cellulare nell'epidermide del SAM. Dimostriamo che GA regola l'orientamento del piano di divisione delle cellule SAM situate tra i primordi degli organi, definendo così l'organizzazione cellulare canonica dell'internodo.
Infine, ci siamo chiesti se qmRGA potesse segnalare variazioni nei livelli di GA endogeno utilizzando ipocotili in crescita. Abbiamo precedentemente dimostrato che il nitrato stimola la crescita aumentando la sintesi di GA e, a sua volta, la degradazione di DELLA34. Di conseguenza, abbiamo osservato che la lunghezza dell'ipocotile nelle piantine pUBQ10::qmRGA cresciute in condizioni di abbondante apporto di nitrato (10 mM NO3−) era significativamente maggiore rispetto a quella delle piantine cresciute in condizioni di carenza di nitrato (Figura 6a supplementare). Coerentemente con la risposta di crescita, i segnali di GA erano più elevati negli ipocotili delle piantine cresciute in condizioni di 10 mM NO3− rispetto alle piantine cresciute in assenza di nitrato (Figura 6b, c supplementare). Pertanto, qmRGA consente anche il monitoraggio delle variazioni nella segnalazione di GA indotte da variazioni endogene nella concentrazione di GA.
Per comprendere se l'attività di segnalazione GA rilevata da qmRGA dipenda dalla concentrazione di GA e dalla sua percezione, come previsto in base al design del sensore, abbiamo analizzato l'espressione dei tre recettori GID1 nei tessuti vegetativi e riproduttivi. Nelle piantine, la linea reporter GID1-GUS ha mostrato che GID1a e c erano altamente espressi nei cotiledoni (Fig. 3a–c). Inoltre, tutti e tre i recettori erano espressi nelle foglie, nei primordi laterali delle radici, negli apici radicali (ad eccezione della cuffia radicale di GID1b) e nel sistema vascolare (Fig. 3a–c). Nel SAM dell'infiorescenza, abbiamo rilevato segnali GUS solo per GID1b e 1c (Fig. 7a–c supplementare). L'ibridazione in situ ha confermato questi pattern di espressione e ha ulteriormente dimostrato che GID1c era espresso uniformemente a bassi livelli nel SAM, mentre GID1b mostrava un'espressione più elevata alla periferia del SAM (Fig. 7d–l supplementare). La fusione traduzionale pGID1b::2xmTQ2-GID1b ha inoltre rivelato un intervallo graduato di espressione di GID1b, da bassa o nulla espressione al centro del SAM ad alta espressione ai margini dell'organo (Fig. 7m supplementare). Pertanto, i recettori GID1 non sono distribuiti uniformemente nei tessuti e al loro interno. In esperimenti successivi, abbiamo anche osservato che la sovraespressione di GID1 (pUBQ10::GID1a-mCherry) aumentava la sensibilità di qmRGA negli ipocotili all'applicazione esterna di GA (Fig. 3d, e). Al contrario, la fluorescenza misurata da qd17mRGA nell'ipocotilo era insensibile al trattamento con GA3 (Fig. 3f, g). Per entrambi i test, le piantine sono state trattate con alte concentrazioni di GA (100 μM GA3) per valutare il comportamento rapido del sensore, dove la capacità di legarsi al recettore GID1 risultava aumentata o persa. Nel complesso, questi risultati confermano che il biosensore qmRGA svolge una funzione combinata di sensore GA e GA e suggeriscono che l'espressione differenziale del recettore GID1 può modulare significativamente l'emissività del sensore.
Ad oggi, la distribuzione dei segnali GA nel SAM rimane poco chiara. Pertanto, abbiamo utilizzato piante che esprimono qmRGA e il reporter di cellule staminali pCLV3::mCherry-NLS35 per calcolare mappe quantitative ad alta risoluzione dell'attività di segnalazione GA, concentrandoci sullo strato L1 (epidermide; Fig. 4a, b, vedi Metodi e Metodi Supplementari), poiché L1 svolge un ruolo chiave nel controllo della crescita del SAM36. In questo caso, l'espressione di pCLV3::mCherry-NLS ha fornito un punto di riferimento geometrico fisso per analizzare la distribuzione spaziotemporale dell'attività di segnalazione GA37. Sebbene GA sia considerato essenziale per lo sviluppo degli organi laterali4, abbiamo osservato che i segnali GA erano bassi nel primordio fiorale (P) a partire dallo stadio P3 (Fig. 4a, b), mentre i primordi giovani P1 e P2 presentavano un'attività moderata, simile a quella della regione centrale (Fig. 4a, b). Una maggiore attività di segnalazione GA è stata rilevata ai confini dei primordi degli organi, a partire da P1/P2 (ai lati del confine) e con un picco a P4, così come in tutte le cellule della regione periferica situata tra i primordi (Fig. 4a, b e Fig. 8a, b supplementari). Questa maggiore attività di segnalazione GA è stata osservata non solo nell'epidermide, ma anche negli strati L2 e L3 superiore (Fig. 8b supplementare). Anche il pattern dei segnali GA rilevato nel SAM utilizzando qmRGA è rimasto invariato nel tempo (Fig. 8c–f, k supplementari). Sebbene il costrutto qd17mRGA sia stato sistematicamente sottoregolato nel SAM di piante T3 provenienti da cinque linee indipendenti che abbiamo caratterizzato in dettaglio, siamo stati in grado di analizzare i pattern di fluorescenza ottenuti con il costrutto pRPS5a::VENUS-2A-TagBFP (Fig. 8g–j, l supplementari). In questa linea di controllo, sono state rilevate solo lievi variazioni nel rapporto di fluorescenza nel SAM, ma nel centro del SAM abbiamo osservato una chiara e inaspettata diminuzione di VENUS associata a TagBFP. Ciò conferma che il pattern di segnalazione osservato da qmRGA riflette la degradazione di mRGA-VENUS dipendente da GA, ma dimostra anche che qmRGA potrebbe sovrastimare l'attività di segnalazione di GA nel centro del meristema. In sintesi, i nostri risultati rivelano un pattern di segnalazione di GA che riflette principalmente la distribuzione dei primordi. Questa distribuzione della regione interprimordiale (IPR) è dovuta al graduale instaurarsi di un'elevata attività di segnalazione di GA tra il primordio in via di sviluppo e la regione centrale, mentre allo stesso tempo l'attività di segnalazione di GA nel primordio diminuisce (Fig. 4c, d).
La distribuzione dei recettori GID1b e GID1c (vedi sopra) suggerisce che l'espressione differenziale dei recettori GA contribuisca a modellare il pattern dell'attività di segnalazione GA nel SAM. Ci siamo chiesti se l'accumulo differenziale di GA potesse essere coinvolto. Per indagare questa possibilità, abbiamo utilizzato il sensore FRET nlsGPS1 GA21. Un aumento della frequenza di attivazione è stato rilevato nel SAM di nlsGPS1 trattato con 10 μM di GA4+7 per 100 minuti (Fig. 9a–e supplementari), indicando che nlsGPS1 risponde alle variazioni della concentrazione di GA nel SAM, come avviene nelle radici21. La distribuzione spaziale della frequenza di attivazione di nlsGPS1 ha rivelato livelli di GA relativamente bassi negli strati esterni del SAM, ma ha mostrato che erano elevati al centro e ai bordi del SAM (Fig. 4e e Fig. 9a,c supplementari). Ciò suggerisce che anche GA è distribuito nel SAM con un pattern spaziale paragonabile a quello rivelato da qmRGA. Come approccio complementare, abbiamo anche trattato il SAM con GA fluorescente (GA3-, GA4-, GA7-Fl) o con Fl da solo come controllo negativo. Il segnale di Fl era distribuito in tutto il SAM, inclusa la regione centrale e il primordio, sebbene a un'intensità inferiore (Fig. 4j e Figura 10d supplementare). Al contrario, tutti e tre i GA-Fl si accumulavano specificamente all'interno dei bordi del primordio e in misura variabile nel resto dell'IPR, con GA7-Fl che si accumulava nel dominio più ampio dell'IPR (Fig. 4k e Figure 10a,b supplementari). La quantificazione dell'intensità di fluorescenza ha rivelato che il rapporto tra intensità IPR e non IPR era maggiore nel SAM trattato con GA-Fl rispetto al SAM trattato con Fl (Fig. 4l e Figura 10c supplementare). Insieme, questi risultati suggeriscono che GA è presente a concentrazioni più elevate nelle cellule IPR che si trovano più vicine al bordo dell'organo. Ciò suggerisce che il pattern di segnalazione GA di SAM derivi sia dall'espressione differenziale dei recettori GA sia dall'accumulo differenziale di GA nelle cellule IPR in prossimità dei confini degli organi. Pertanto, la nostra analisi ha rivelato un pattern spaziotemporale inaspettato della segnalazione GA, con un'attività inferiore al centro e al primordio di SAM e un'attività superiore nell'IPR nella regione periferica.
Per comprendere il ruolo dell'attività di segnalazione differenziale di GA nel SAM, abbiamo analizzato la correlazione tra attività di segnalazione di GA, espansione cellulare e divisione cellulare utilizzando l'imaging time-lapse in tempo reale del qmRGA pCLV3::mCherry-NLS del SAM. Dato il ruolo di GA nella regolazione della crescita, ci si aspettava una correlazione positiva con i parametri di espansione cellulare. Pertanto, abbiamo prima confrontato le mappe dell'attività di segnalazione di GA con le mappe del tasso di crescita della superficie cellulare (come proxy per l'intensità dell'espansione cellulare per una data cellula e per le cellule figlie in divisione) e con le mappe dell'anisotropia di crescita, che misura la direzionalità dell'espansione cellulare (utilizzata anche qui per una data cellula e per le cellule figlie in divisione; Fig. 5a, b, vedi Metodi e Metodi Supplementari). Le nostre mappe del tasso di crescita della superficie cellulare del SAM sono coerenti con osservazioni precedenti38,39, con tassi di crescita minimi al bordo e tassi di crescita massimi nei fiori in via di sviluppo (Fig. 5a). L'analisi delle componenti principali (PCA) ha mostrato che l'attività di segnalazione di GA era negativamente correlata all'intensità di crescita della superficie cellulare (Figura 5c). Abbiamo anche dimostrato che i principali assi di variazione, inclusi l'input di segnalazione di GA e l'intensità di crescita, erano ortogonali alla direzione determinata dall'elevata espressione di CLV3, confermando l'esclusione delle cellule dal centro SAM nelle restanti analisi. L'analisi di correlazione di Spearman ha confermato i risultati della PCA (Figura 5d), indicando che segnali di GA più elevati nell'IPR non si traducevano in una maggiore espansione cellulare. Tuttavia, l'analisi di correlazione ha rivelato una lieve correlazione positiva tra l'attività di segnalazione di GA e l'anisotropia di crescita (Figure 5c, d), suggerendo che un aumento della segnalazione di GA nell'IPR influenzi la direzione della crescita cellulare e possibilmente la posizione del piano di divisione cellulare.
a, b Mappe di calore della crescita superficiale media (a) e dell'anisotropia di crescita (b) in SAM, calcolate su sette piante indipendenti (utilizzate rispettivamente come indicatori dell'intensità e della direzione dell'espansione cellulare). c L'analisi PCA ha incluso le seguenti variabili: segnale GA, intensità di crescita superficiale, anisotropia di crescita superficiale ed espressione di CLV3. La componente 1 della PCA era principalmente correlata negativamente con l'intensità di crescita superficiale e positivamente correlata con il segnale GA. La componente 2 della PCA era principalmente correlata positivamente con l'anisotropia di crescita superficiale e negativamente correlata con l'espressione di CLV3. Le percentuali rappresentano la variazione spiegata da ciascuna componente. d Analisi della correlazione di Spearman tra segnale GA, intensità di crescita superficiale e anisotropia di crescita superficiale a scala tissutale, esclusa la CZ. Il numero a destra rappresenta il valore rho di Spearman tra due variabili. Gli asterischi indicano i casi in cui la correlazione/correlazione negativa è altamente significativa. e Visualizzazione 3D delle cellule L1 di SAM Col-0 mediante microscopia confocale. Le nuove pareti cellulari formate nel SAM (ma non nel primordio) a 10 ore sono colorate in base ai loro valori angolari. La barra colorata è mostrata nell'angolo in basso a destra. L'inserto mostra l'immagine 3D corrispondente a 0 ore. L'esperimento è stato ripetuto due volte con risultati simili. f I box plot mostrano i tassi di divisione cellulare nel SAM IPR e non-IPR Col-0 (n = 10 piante indipendenti). La linea centrale mostra la mediana e i bordi dei box indicano il 25° e il 75° percentile. I baffi indicano i valori minimo e massimo determinati con il software R. I valori p sono stati ottenuti con il t-test a due code di Welch. g, h Diagramma schematico che mostra (g) come misurare l'angolo della nuova parete cellulare (magenta) rispetto alla direzione radiale dal centro del SAM (linea tratteggiata bianca) (sono considerati solo i valori di angolo acuto, ovvero 0-90°), e (h) le direzioni circonferenziale/laterale e radiale all'interno del meristema. i Istogrammi di frequenza dell'orientamento del piano di divisione cellulare attraverso il SAM (blu scuro), l'IPR (blu medio) e il non-IPR (blu chiaro), rispettivamente. I valori p sono stati ottenuti tramite un test di Kolmogorov-Smirnov a due code. L'esperimento è stato ripetuto due volte con risultati simili. j Istogrammi di frequenza dell'orientamento del piano di divisione cellulare dell'IPR attorno a P3 (verde chiaro), P4 (verde medio) e P5 (verde scuro), rispettivamente. I valori p sono stati ottenuti tramite un test di Kolmogorov-Smirnov a due code. L'esperimento è stato ripetuto due volte con risultati simili.
Pertanto, abbiamo successivamente studiato la correlazione tra la segnalazione di GA e l'attività di divisione cellulare identificando le pareti cellulari di nuova formazione durante il test (Fig. 5e). Questo approccio ci ha permesso di misurare la frequenza e la direzione della divisione cellulare. Sorprendentemente, abbiamo scoperto che la frequenza delle divisioni cellulari nell'IPR e nel resto del SAM (non-IPR, Fig. 5f) era simile, indicando che le differenze nella segnalazione di GA tra cellule IPR e non-IPR non influenzano significativamente la divisione cellulare. Questo, e la correlazione positiva tra la segnalazione di GA e l'anisotropia di crescita, ci hanno spinto a considerare se l'attività di segnalazione di GA potesse influenzare l'orientamento del piano di divisione cellulare. Abbiamo misurato l'orientamento della nuova parete cellulare come un angolo acuto rispetto all'asse radiale che collega il centro del meristema e il centro della nuova parete cellulare (Fig. 5e-i) e abbiamo osservato una chiara tendenza delle cellule a dividersi ad angoli prossimi a 90° rispetto all'asse radiale, con le frequenze più elevate osservate a 70–80° (23,28%) e 80–90° (22,62%) (Fig. 5e,i), corrispondenti a divisioni cellulari in direzione circonferenziale/trasversale (Fig. 5h). Per esaminare il contributo della segnalazione GA a questo comportamento di divisione cellulare, abbiamo analizzato separatamente i parametri di divisione cellulare nell'IPR e nel non-IPR (Fig. 5i). Abbiamo osservato che la distribuzione dell'angolo di divisione nelle cellule IPR differiva da quella delle cellule non-IPR o delle cellule dell'intero SAM, con le cellule IPR che mostravano una maggiore proporzione di divisioni cellulari laterali/circolari, ovvero 70-80° e 80-90° (rispettivamente 33,86% e 30,71%, proporzioni corrispondenti) (Fig. 5i). Pertanto, le nostre osservazioni hanno rivelato un'associazione tra un'elevata segnalazione di GA e un orientamento del piano di divisione cellulare vicino alla direzione circonferenziale, simile alla correlazione tra l'attività di segnalazione di GA e l'anisotropia di crescita (Fig. 5c, d). Per stabilire ulteriormente la conservazione spaziale di questa associazione, abbiamo misurato l'orientamento del piano di divisione nelle cellule IPR che circondano il primordio a partire da P3, poiché la più elevata attività di segnalazione di GA è stata rilevata in questa regione a partire da P4 (Fig. 4). Gli angoli di divisione dell'IPR attorno a P3 e P4 non hanno mostrato differenze statisticamente significative, sebbene sia stata osservata una maggiore frequenza di divisioni cellulari laterali nell'IPR attorno a P4 (Fig. 5j). Tuttavia, nelle cellule IPR attorno a P5, la differenza nell'orientamento del piano di divisione cellulare è diventata statisticamente significativa, con un netto aumento della frequenza di divisioni cellulari trasversali (Fig. 5j). Insieme, questi risultati suggeriscono che la segnalazione GA può controllare l'orientamento delle divisioni cellulari nel SAM, il che è coerente con precedenti studi40,41 secondo cui un'elevata segnalazione GA può indurre l'orientamento laterale delle divisioni cellulari nell'IPR.
Si prevede che le cellule nell'IPR non vengano incorporate nei primordi, ma piuttosto negli internodi2,42,43. L'orientamento trasversale delle divisioni cellulari nell'IPR può determinare la tipica organizzazione di file longitudinali parallele di cellule epidermiche negli internodi. Le nostre osservazioni sopra descritte suggeriscono che la segnalazione GA probabilmente svolga un ruolo in questo processo, regolando la direzione della divisione cellulare.
La perdita di funzione di diversi geni DELLA determina una risposta costitutiva all'alopecia androgenetica (GA), e i mutanti della possono essere utilizzati per testare questa ipotesi44. Abbiamo inizialmente analizzato i pattern di espressione di cinque geni DELLA nel SAM. La fusione trascrizionale della linea GUS45 ha rivelato che GAI, RGA, RGL1 e RGL2 (in misura molto minore) erano espressi nel SAM (Fig. 11a–d supplementari). L'ibridazione in situ ha ulteriormente dimostrato che l'mRNA di GAI si accumula specificamente nei primordi e nei fiori in via di sviluppo (Fig. 11e supplementari). L'mRNA di RGL1 e RGL3 è stato rilevato in tutta la chioma del SAM e nei fiori più vecchi, mentre l'mRNA di RGL2 era più abbondante nella regione di confine (Fig. 11f–h supplementari). L'imaging confocale del SAM pRGL3::RGL3-GFP ha confermato l'espressione osservata mediante ibridazione in situ e ha mostrato che la proteina RGL3 si accumula nella parte centrale del SAM (Fig. 11i supplementare). Utilizzando la linea pRGA::GFP-RGA, abbiamo anche riscontrato che la proteina RGA si accumula nel SAM, ma la sua abbondanza diminuisce al confine a partire da P4 (Fig. 11j supplementare). In particolare, i pattern di espressione di RGL3 e RGA sono coerenti con una maggiore attività di segnalazione GA nell'IPR, come rilevato da qmRGA (Fig. 4). Inoltre, questi dati indicano che tutte le DELLA sono espresse nel SAM e che la loro espressione si estende collettivamente all'intero SAM.
Abbiamo poi analizzato i parametri di divisione cellulare nel SAM wild-type (Ler, controllo) e nei mutanti quintuple (global) della gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 (Fig. 6a, b). È interessante notare che abbiamo osservato uno spostamento statisticamente significativo nella distribuzione delle frequenze degli angoli di divisione cellulare nel SAM del mutante globale della rispetto al wild-type (Fig. 6c). Questo cambiamento nel mutante globale della era dovuto a un aumento della frequenza degli angoli di 80–90° (34,71% vs. 24,55%) e, in misura minore, degli angoli di 70–80° (23,78% vs. 20,18%), corrispondenti cioè a divisioni cellulari trasversali (Fig. 6c). Anche la frequenza delle divisioni non trasversali (0–60°) era inferiore nel mutante globale della (Fig. 6c). La frequenza delle divisioni cellulari trasversali è risultata significativamente aumentata nel SAM del mutante globale della (Fig. 6b). Anche la frequenza delle divisioni cellulari trasversali nell'IPR era maggiore nel mutante globale della rispetto al tipo selvatico (Fig. 6d). Al di fuori della regione IPR, il tipo selvatico presentava una distribuzione più uniforme degli angoli di divisione cellulare, mentre il mutante globale della preferiva divisioni tangenziali come l'IPR (Fig. 6e). Abbiamo anche quantificato l'orientamento delle divisioni cellulari nel SAM dei mutanti quintupli della ga2 ossidasi (ga2ox) (ga2ox1-1, ga2ox2-1, ga2ox3-1, ga2ox4-1 e ga2ox6-2), un background mutante inattivo per GA in cui GA si accumula. In linea con l'aumento dei livelli di GA, il SAM dell'infiorescenza mutante ga2ox quintupla era maggiore di quello di Col-0 (Fig. 12a, b supplementari) e, rispetto a Col-0, il SAM ga2ox quintupla mostrava una distribuzione nettamente diversa degli angoli di divisione cellulare, con la frequenza angolare che aumentava da 50° a 90°, favorendo ancora una volta le divisioni tangenziali (Fig. 12a–c supplementari). Pertanto, dimostriamo che l'attivazione costitutiva della segnalazione GA e l'accumulo di GA inducono divisioni cellulari laterali nell'IPR e nel resto del SAM.
a, b Visualizzazione 3D dello strato L1 del SAM di Ler (a) colorato con PI e del mutante globale della (b) mediante microscopia confocale. Le nuove pareti cellulari formatesi nel SAM (ma non nel primordio) in un periodo di 10 ore sono mostrate e colorate in base ai loro valori angolari. L'inserto mostra il SAM a 0 ore. La barra colorata è visualizzata nell'angolo in basso a destra. La freccia in (b) indica un esempio di file cellulari allineati nel mutante globale della. L'esperimento è stato ripetuto due volte con risultati simili. c Confronto della distribuzione di frequenza degli orientamenti del piano di divisione cellulare nell'intero SAM (d), IPR (e) e non-IPR (f) tra Ler e della globale. I valori p sono stati ottenuti utilizzando un test di Kolmogorov-Smirnov a due code. f, g Visualizzazione 3D di immagini confocali del SAM colorato con PI delle piante transgeniche Col-0 (i) e pCUC2::gai-1-VENUS (j). I pannelli (a, b) mostrano nuove pareti cellulari (ma non primordi) formate nel SAM entro 10 ore. L'esperimento è stato ripetuto due volte con risultati simili. h–j Confronto della distribuzione di frequenza degli orientamenti del piano di divisione cellulare localizzati nell'intero SAM (h), IPR (i) e non-IPR (j) tra piante Col-0 e pCUC2::gai-1-VENUS. I valori di p sono stati ottenuti utilizzando un test di Kolmogorov-Smirnov a due code.
Abbiamo poi testato l'effetto dell'inibizione specifica della segnalazione GA nell'IPR. A tal fine, abbiamo utilizzato il promotore della coppa 2 del cotiledone (CUC2) per indurre l'espressione di una proteina gai-1 dominante negativa fusa con VENUS (nella linea pCUC2::gai-1-VENUS). Nel SAM selvatico, il promotore CUC2 induce l'espressione della maggior parte degli IPR nel SAM, incluse le cellule di confine, da P4 in poi, e un'espressione specifica simile è stata osservata nelle piante pCUC2::gai-1-VENUS (vedi sotto). La distribuzione degli angoli di divisione cellulare attraverso il SAM o l'IPR delle piante pCUC2::gai-1-VENUS non era significativamente diversa da quella del tipo selvatico, sebbene inaspettatamente abbiamo riscontrato che le cellule senza IPR in queste piante si dividevano a una frequenza maggiore di 80-90° (Fig. 6f-j).
È stato suggerito che la direzione della divisione cellulare dipenda dalla geometria del SAM, in particolare dallo stress di trazione generato dalla curvatura del tessuto46. Ci siamo quindi chiesti se la forma del SAM fosse alterata nelle piante mutanti globali della e pCUC2::gai-1-VENUS. Come riportato in precedenza12, le dimensioni del SAM del mutante globale della erano maggiori di quelle del tipo selvatico (Fig. 13a, b, d supplementari). L'ibridazione in situ di CLV3 e RNA di STM ha confermato l'espansione del meristema nei mutanti della e ha ulteriormente mostrato l'espansione laterale della nicchia delle cellule staminali (Fig. 13e, f, h, i supplementari). Tuttavia, la curvatura del SAM era simile in entrambi i genotipi (Fig. 13k, m, n, p supplementari). Abbiamo osservato un aumento simile delle dimensioni nel mutante quadruplo gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 della senza una variazione della curvatura rispetto al tipo selvatico (Fig. 13c, d, g, j, l, o, p supplementari). Anche la frequenza dell'orientamento della divisione cellulare è stata influenzata nel mutante quadruplo della, ma in misura minore rispetto al mutante monolitico della (Fig. 12d–f supplementari). Questo effetto del dosaggio, insieme alla mancanza di un effetto sulla curvatura, suggerisce che l'attività residua di RGL3 nel mutante quadruplo Della limiti le variazioni dell'orientamento della divisione cellulare causate dalla perdita di attività di DELLA e che le variazioni nelle divisioni cellulari laterali si verificano in risposta a variazioni dell'attività di segnalazione GA piuttosto che a variazioni della geometria SAM. Come descritto sopra, il promotore CUC2 guida l'espressione di IPR nel SAM a partire da P4 (Fig. 14a, b supplementari) e, al contrario, il SAM di pCUC2::gai-1-VENUS presentava dimensioni ridotte ma una curvatura maggiore (Fig. 14c–h supplementari). Questa variazione nella morfologia del SAM di pCUC2::gai-1-VENUS potrebbe comportare una diversa distribuzione degli stress meccanici rispetto al tipo selvatico, in cui gli stress circonferenziali elevati iniziano a una distanza inferiore dal centro del SAM47. In alternativa, le variazioni nella morfologia del SAM di pCUC2::gai-1-VENUS potrebbero derivare da variazioni nelle proprietà meccaniche regionali indotte dall'espressione del transgene48. In entrambi i casi, ciò potrebbe compensare parzialmente gli effetti delle variazioni nella segnalazione GA aumentando la probabilità che le cellule si dividano in orientamento circonferenziale/trasversale, spiegando le nostre osservazioni.
Nel complesso, i nostri dati confermano che una maggiore segnalazione GA gioca un ruolo attivo nell'orientamento laterale del piano di divisione cellulare nell'IPR. Mostrano inoltre che anche la curvatura del meristema influenza l'orientamento del piano di divisione cellulare nell'IPR.
L'orientamento trasversale del piano di divisione nell'IPR, dovuto all'elevata attività di segnalazione di GA, suggerisce che GA pre-organizzi un file cellulare radiale nell'epidermide all'interno del SAM per definire l'organizzazione cellulare che sarà successivamente riscontrata nell'internodo epidermico. In effetti, tali file cellulari erano frequentemente visibili nelle immagini SAM di mutanti globali di Della (Fig. 6b). Pertanto, per esplorare ulteriormente la funzione evolutiva del pattern spaziale della segnalazione di GA nel SAM, abbiamo utilizzato l'imaging time-lapse per analizzare l'organizzazione spaziale delle cellule nell'IPR in piante di tipo selvatico (Ler e Col-0), mutanti globali di Della e piante transgeniche pCUC2::gai-1-VENUS.
Abbiamo scoperto che qmRGA mostrava che l'attività di segnalazione GA nell'IPR aumentava da P1/P2 e raggiungeva il picco a P4, e questo pattern rimaneva costante nel tempo (Fig. 4a–f e Fig. 8c–f, k supplementari). Per analizzare l'organizzazione spaziale delle cellule nell'IPR con l'aumento del segnale GA, abbiamo etichettato le cellule IPR di Ler sopra e ai lati di P4 in base al loro destino evolutivo analizzato 34 ore dopo la prima osservazione, ovvero più di due volte plastidiali, consentendoci di seguire le cellule IPR durante lo sviluppo del primordio da P1/P2 a P4. Abbiamo utilizzato tre colori diversi: giallo per le cellule che si erano integrate nel primordio vicino a P4, verde per quelle che si trovavano nell'IPR e viola per quelle che partecipavano a entrambi i processi (Fig. 7a–c). A t0 (0 ore), 1–2 strati di cellule IPR erano visibili davanti a P4 (Fig. 7a). Come previsto, quando queste cellule si dividevano, lo facevano principalmente attraverso il piano di divisione trasversale (Fig. 7a–c). Risultati simili sono stati ottenuti utilizzando Col-0 SAM (focalizzandosi su P3, il cui bordo si ripiega in modo simile a P4 in Ler), sebbene in questo genotipo la piega formata al bordo fiorale nascondesse più rapidamente le cellule IPR (Fig. 7g–i). Pertanto, il modello di divisione delle cellule IPR pre-organizza le cellule in file radiali, come negli internodi. L'organizzazione delle file radiali e la localizzazione delle cellule IPR tra organi successivi suggeriscono che queste cellule siano progenitori internodali.
In questo studio, abbiamo sviluppato un biosensore ratiometrico per la segnalazione di GA, qmRGA, che consente la mappatura quantitativa dell'attività di segnalazione di GA risultante dalle concentrazioni combinate di GA e recettore GA, riducendo al minimo l'interferenza con le vie di segnalazione endogene, fornendo così informazioni sulla funzione di GA a livello cellulare. A tal fine, abbiamo costruito una proteina DELLA modificata, mRGA, che ha perso la capacità di legare i partner di interazione di DELLA ma rimane sensibile alla proteolisi indotta da GA. qmRGA risponde a variazioni sia esogene che endogene nei livelli di GA e le sue proprietà di rilevamento dinamico consentono la valutazione delle variazioni spaziotemporali nell'attività di segnalazione di GA durante lo sviluppo. qmRGA è anche uno strumento molto flessibile in quanto può essere adattato a diversi tessuti modificando il promotore utilizzato per la sua espressione (se necessario) e, data la natura conservata della via di segnalazione di GA e del motivo PFYRE nelle angiosperme, è probabile che sia trasferibile ad altre specie22. Coerentemente con questo, è stato anche dimostrato che una mutazione equivalente nella proteina DELLA SLR1 del riso (HYY497AAA) sopprime l'attività di repressione della crescita di SLR1, riducendo solo leggermente la sua degradazione mediata da GA, similmente a mRGA23. In particolare, recenti studi in Arabidopsis hanno mostrato che una singola mutazione amminoacidica nel dominio PFYRE (S474L) alterava l'attività trascrizionale di RGA senza comprometterne la capacità di interagire con i partner dei fattori di trascrizione50. Sebbene questa mutazione sia molto vicina alle 3 sostituzioni amminoacidiche presenti in mRGA, i nostri studi dimostrano che queste due mutazioni alterano caratteristiche distinte di DELLA. Sebbene la maggior parte dei partner dei fattori di trascrizione si leghi ai domini LHR1 e SAW di DELLA26,51, alcuni amminoacidi conservati nel dominio PFYRE potrebbero contribuire a stabilizzare queste interazioni.
Lo sviluppo degli internodi è un tratto chiave per l'architettura delle piante e il miglioramento della resa. L'analisi quantitativa di mRGA ha rivelato una maggiore attività di segnalazione di GA nelle cellule progenitrici degli internodi dell'IPR. Combinando imaging quantitativo e genetica, abbiamo dimostrato che i pattern di segnalazione di GA sovrappongono piani di divisione cellulare circolari/trasversali nell'epidermide del SAM, modellando l'organizzazione della divisione cellulare necessaria per lo sviluppo degli internodi. Diversi regolatori dell'orientamento del piano di divisione cellulare sono stati identificati durante lo sviluppo52,53. Il nostro lavoro fornisce un chiaro esempio di come l'attività di segnalazione di GA regoli questo parametro cellulare. DELLA può interagire con complessi proteici di prefolding41, quindi la segnalazione di GA può regolare l'orientamento del piano di divisione cellulare influenzando direttamente l'orientamento dei microtubuli corticali40,41,54,55. Abbiamo inaspettatamente dimostrato che nel SAM, il correlato di una maggiore attività di segnalazione di GA non era l'allungamento o la divisione cellulare, ma solo l'anisotropia della crescita, il che è coerente con un effetto diretto di GA sulla direzione della divisione cellulare nell'IPR. Tuttavia, non possiamo escludere che questo effetto possa essere anche indiretto, ad esempio mediato dall'ammorbidimento della parete cellulare indotto da GA56. Le alterazioni delle proprietà della parete cellulare inducono stress meccanico57,58, che può anche influenzare l'orientamento del piano di divisione cellulare influenzando l'orientamento dei microtubuli corticali39,46,59. Gli effetti combinati dello stress meccanico indotto da GA e della regolazione diretta dell'orientamento dei microtubuli da parte di GA potrebbero essere coinvolti nella generazione di uno specifico modello di orientamento della divisione cellulare nell'IPR per definire gli internodi, e sono necessari ulteriori studi per testare questa idea. Analogamente, studi precedenti hanno evidenziato l'importanza delle proteine TCP14 e 15 che interagiscono con DELLA nel controllo della formazione degli internodi60,61 e questi fattori potrebbero mediare l'azione di GA insieme a BREVIPEDICELLUS (BP) e PENNYWISE (PNY), che regolano lo sviluppo degli internodi e hanno dimostrato di influenzare la segnalazione di GA2,62. Dato che le DELLA interagiscono con le vie di segnalazione dei brassinosteroidi, dell'etilene, dell'acido jasmonico e dell'acido abscissico (ABA)63,64 e che questi ormoni possono influenzare l'orientamento dei microtubuli65, gli effetti dell'GA sull'orientamento della divisione cellulare possono essere mediati anche da altri ormoni.
Precedenti studi citologici hanno dimostrato che sia le regioni interne che esterne del SAM di Arabidopsis sono necessarie per lo sviluppo degli internodi2,42. Il fatto che l'acido GA regoli attivamente la divisione cellulare nei tessuti interni12 supporta una duplice funzione dell'acido GA nella regolazione delle dimensioni del meristema e degli internodi nel SAM. Anche il modello di divisione cellulare direzionale è strettamente regolato nel tessuto del SAM interno e questa regolazione è essenziale per la crescita del fusto52. Sarà interessante esaminare se l'acido GA svolga anche un ruolo nell'orientamento del piano di divisione cellulare nell'organizzazione del SAM interno, sincronizzando così la specificazione e lo sviluppo degli internodi all'interno del SAM.
Le piante sono state coltivate in vitro in terreno o in terreno di coltura Murashige-Skoog (MS) 1x (Duchefa) addizionato con l'1% di saccarosio e l'1% di agar (Sigma) in condizioni standard (16 ore di luce, 22 °C), ad eccezione degli esperimenti di crescita dell'ipocotile e delle radici in cui le piantine sono state coltivate su piastre verticali sotto luce costante e 22 °C. Per gli esperimenti con nitrato, le piante sono state coltivate su terreno di coltura MS modificato (bioWORLD plant medium) addizionato con un'adeguata quantità di nitrato (0 o 10 mM KNO3), 0,5 mM di NH4-succinato, l'1% di saccarosio e l'1% di agar A (Sigma) in condizioni di giorno lungo.
Il cDNA di GID1a inserito in pDONR221 è stato ricombinato con pDONR P4-P1R-pUBQ10 e pDONR P2R-P3-mCherry in pB7m34GW per generare pUBQ10::GID1a-mCherry. Il DNA di IDD2 inserito in pDONR221 è stato ricombinato in pB7RWG266 per generare p35S:IDD2-RFP. Per generare pGID1b::2xmTQ2-GID1b, un frammento da 3,9 kb a monte della regione codificante GID1b e un frammento da 4,7 kb contenente il cDNA GID1b (1,3 kb) e il terminatore (3,4 kb) sono stati prima amplificati utilizzando i primer nella Tabella supplementare 3 e poi inseriti rispettivamente in pDONR P4-P1R (Thermo Fisher Scientific) e pDONR P2R-P3 (Thermo Fisher Scientific) e infine ricombinati con pDONR221 2xmTQ268 nel vettore target pGreen 012567 utilizzando la clonazione Gateway. Per generare pCUC2::LSSmOrange, la sequenza del promotore CUC2 (3229 bp a monte di ATG), seguita dalla sequenza codificante di large Stokes-shifted mOrange (LSSmOrange)69 con il segnale di localizzazione nucleare N7 e il terminatore trascrizionale NOS, è stata assemblata nel vettore di targeting per kanamicina pGreen utilizzando il sistema di ricombinazione a 3 frammenti Gateway (Invitrogen). Il vettore binario vegetale è stato introdotto rispettivamente nel ceppo GV3101 di Agrobacterium tumefaciens e nelle foglie di Nicotiana benthamiana mediante il metodo di infiltrazione di Agrobacterium e in Arabidopsis thaliana Col-0 mediante il metodo di immersione floreale. pUBQ10::qmRGA pUBQ10::GID1a-mCherry e pCLV3::mCherry-NLS qmRGA sono stati isolati rispettivamente dalle progenie F3 e F1 dei rispettivi incroci.
L'ibridazione in situ dell'RNA è stata eseguita su apici di germogli lunghi circa 1 cm72, che sono stati raccolti e immediatamente fissati in soluzione di FAA (formaldeide al 3,7%, acido acetico al 5%, etanolo al 50%) preraffreddata a 4 °C. Dopo 2 trattamenti sotto vuoto da 15 minuti, il fissativo è stato cambiato e i campioni sono stati incubati per una notte. I cDNA di GID1a, GID1b, GID1c, GAI, RGL1, RGL2 e RGL3 e le sonde antisenso per le loro 3'-UTR sono stati sintetizzati utilizzando i primer mostrati nella Tabella Supplementare 3, come descritto da Rosier et al.73. Le sonde marcate con digossigenina sono state immunodetestate utilizzando anticorpi anti-digossigenina (diluizione 3000 volte; Roche, numero di catalogo: 11 093 274 910) e le sezioni sono state colorate con una soluzione di 5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato (BCIP, diluizione 250 volte)/nitroblu di tetrazolio (NBT, diluizione 200 volte).
Data di pubblicazione: 10 febbraio 2025