In questo studio, gli effetti stimolanti del trattamento combinato diregolatori della crescita delle pianteSono stati studiati gli effetti di (2,4-D e kinetina) e nanoparticelle di ossido di ferro (Fe₃O₄-NPs) sulla morfogenesi in vitro e sulla produzione di metaboliti secondari in *Hypericum perforatum* L. Il trattamento ottimizzato [2,4-D (0,5 mg/L) + kinetina (2 mg/L) + Fe₃O₄-NPs (4 mg/L)] ha migliorato significativamente i parametri di crescita della pianta: l'altezza della pianta è aumentata del 59,6%, la lunghezza delle radici del 114,0%, il numero di gemme del 180,0% e il peso fresco del callo del 198,3% rispetto al gruppo di controllo. Questo trattamento combinato ha anche migliorato l'efficienza di rigenerazione (50,85%) e aumentato il contenuto di ipericina del 66,6%. L'analisi GC-MS ha rivelato un elevato contenuto di iperoside, β-patolene e alcol cetilico, che rappresenta il 93,36% dell'area totale del picco, mentre il contenuto di fenoli totali e flavonoidi è aumentato fino all'80,1%. Questi risultati indicano che i regolatori della crescita delle piante (PGR) e le nanoparticelle di Fe₃O₄ (Fe₃O₄-NP) esercitano un effetto sinergico stimolando l'organogenesi e l'accumulo di composti bioattivi, il che rappresenta una strategia promettente per il miglioramento biotecnologico delle piante medicinali.
L'iperico (Hypericum perforatum L.), noto anche come erba di San Giovanni, è una pianta erbacea perenne della famiglia delle Hypericaceae che ha un valore economico.[1] I suoi potenziali componenti bioattivi includono tannini naturali, xantoni, floroglucinolo, naftalendiantrone (iperina e pseudoiperina), flavonoidi, acidi fenolici e oli essenziali.[2,3,4] L'iperico può essere propagato con metodi tradizionali; tuttavia, la stagionalità dei metodi tradizionali, la bassa germinazione dei semi e la suscettibilità alle malattie limitano il suo potenziale per la coltivazione su larga scala e la formazione continua di metaboliti secondari.[1,5,6]
Pertanto, la coltura tissutale in vitro è considerata un metodo efficace per la rapida propagazione delle piante, la conservazione delle risorse di germoplasma e l'aumento della resa di composti medicinali [7, 8]. I regolatori della crescita delle piante (PGR) svolgono un ruolo cruciale nella regolazione della morfogenesi e sono necessari per la coltivazione in vitro di callo e organismi interi. L'ottimizzazione delle loro concentrazioni e combinazioni è fondamentale per il completamento con successo di questi processi di sviluppo [9]. Pertanto, comprendere la composizione e la concentrazione appropriate dei regolatori è importante per migliorare la crescita e la capacità rigenerativa dell'iperico (H. perforatum) [10].
Le nanoparticelle di ossido di ferro (Fe₃O₄) sono una classe di nanoparticelle che sono state o sono in fase di sviluppo per la coltura tissutale. Le Fe₃O₄ possiedono significative proprietà magnetiche, una buona biocompatibilità e la capacità di promuovere la crescita delle piante e ridurre lo stress ambientale, pertanto hanno attirato notevole attenzione nella progettazione di colture tissutali. Le potenziali applicazioni di queste nanoparticelle possono includere l'ottimizzazione della coltura in vitro per promuovere la divisione cellulare, migliorare l'assorbimento dei nutrienti e attivare gli enzimi antiossidanti [11].
Sebbene le nanoparticelle abbiano dimostrato buoni effetti promotori sulla crescita delle piante, gli studi sull'applicazione combinata di nanoparticelle di Fe₃O₄ e regolatori di crescita vegetale ottimizzati in *H. perforatum* rimangono scarsi. Per colmare questa lacuna di conoscenza, il presente studio ha valutato gli effetti della loro combinazione sulla morfogenesi in vitro e sulla produzione di metaboliti secondari, al fine di fornire nuove informazioni per il miglioramento delle caratteristiche delle piante medicinali. Pertanto, questo studio ha due obiettivi: (1) ottimizzare la concentrazione di regolatori di crescita vegetale per promuovere efficacemente la formazione di callo, la rigenerazione dei germogli e la radicazione in vitro; e (2) valutare gli effetti delle nanoparticelle di Fe₃O₄ sui parametri di crescita in vitro. I piani futuri includono la valutazione del tasso di sopravvivenza delle piante rigenerate durante l'acclimatamento (in vitro). Si prevede che i risultati di questo studio miglioreranno significativamente l'efficienza della micropropagazione di *H. perforatum*, contribuendo così all'uso sostenibile e alle applicazioni biotecnologiche di questa importante pianta medicinale.
In questo studio, abbiamo ottenuto espianti fogliari da piante annuali di iperico coltivate in campo (piante madri). Questi espianti sono stati utilizzati per ottimizzare le condizioni di coltura in vitro. Prima della coltura, le foglie sono state accuratamente risciacquate sotto acqua distillata corrente per diversi minuti. Le superfici degli espianti sono state quindi disinfettate mediante immersione in etanolo al 70% per 30 secondi, seguita da immersione in una soluzione di ipoclorito di sodio (NaOCl) all'1,5% contenente alcune gocce di Tween 20 per 10 minuti. Infine, gli espianti sono stati risciacquati tre volte con acqua distillata sterile prima di essere trasferiti nel successivo terreno di coltura.
Nelle quattro settimane successive, sono stati misurati i parametri di rigenerazione dei germogli, tra cui il tasso di rigenerazione, il numero di germogli per espianto e la lunghezza dei germogli. Quando i germogli rigenerati hanno raggiunto una lunghezza di almeno 2 cm, sono stati trasferiti in un mezzo di radicazione costituito da mezzo MS a metà concentrazione, acido indolbutirrico (IBA) a 0,5 mg/L e gomma di guar allo 0,3%. La coltura di radicazione è proseguita per tre settimane, durante le quali sono stati misurati il tasso di radicazione, il numero di radici e la lunghezza delle radici. Ciascun trattamento è stato ripetuto tre volte, con 10 espianti coltivati per replica, ottenendo circa 30 espianti per trattamento.
L'altezza delle piante è stata misurata in centimetri (cm) utilizzando un righello, dalla base della pianta alla punta della foglia più alta. La lunghezza delle radici è stata misurata in millimetri (mm) immediatamente dopo aver rimosso con cura le piantine e il substrato di coltivazione. Il numero di gemme per espianto è stato contato direttamente su ciascuna pianta. Il numero di macchie nere sulle foglie, note come noduli, è stato misurato visivamente. Si ritiene che questi noduli neri siano ghiandole contenenti ipericina, o macchie ossidative, e vengono utilizzati come indicatore fisiologico della risposta della pianta al trattamento. Dopo aver rimosso tutto il substrato di coltivazione, il peso fresco delle piantine è stato misurato utilizzando una bilancia elettronica con una precisione di milligrammi (mg).
Il metodo per calcolare la velocità di formazione del callo è il seguente: dopo aver coltivato gli espianti in un mezzo contenente vari regolatori di crescita (chinasi, 2,4-D e Fe3O4) per quattro settimane, si conta il numero di espianti in grado di formare callo. La formula per calcolare la velocità di formazione del callo è la seguente:
Ciascun trattamento è stato ripetuto tre volte, con almeno 10 espianti esaminati in ogni ripetizione.
Il tasso di rigenerazione riflette la proporzione di tessuto calloso che completa con successo il processo di differenziazione delle gemme dopo la fase di formazione del callo. Questo indicatore dimostra la capacità del tessuto calloso di trasformarsi in tessuto differenziato e di svilupparsi in nuovi organi vegetali.
Il coefficiente di radicazione è il rapporto tra il numero di rami in grado di radicare e il numero totale di rami. Questo indicatore riflette il successo della fase di radicazione, cruciale nella micropropagazione e nella propagazione delle piante, poiché un buon radicamento aiuta le piantine a sopravvivere meglio nelle condizioni di crescita.
I composti dell'ipericina sono stati estratti con metanolo al 90%. Cinquanta mg di materiale vegetale essiccato sono stati aggiunti a 1 ml di metanolo e sonicati per 20 min a 30 kHz in un pulitore a ultrasuoni (modello A5120-3YJ) a temperatura ambiente al buio. Dopo la sonicazione, il campione è stato centrifugato a 6000 rpm per 15 min. Il supernatante è stato raccolto e l'assorbanza dell'ipericina è stata misurata a 592 nm utilizzando uno spettrofotometro Plus-3000 S secondo il metodo descritto da Conceiçao et al. [14].
La maggior parte dei trattamenti con regolatori di crescita vegetale (PGR) e nanoparticelle di ossido di ferro (Fe₃O₄-NPs) non ha indotto la formazione di noduli neri sulle foglie dei germogli rigenerati. Non sono stati osservati noduli in nessuno dei trattamenti con 0,5 o 1 mg/L di 2,4-D, 0,5 o 1 mg/L di kinetina, o 1, 2 o 4 mg/L di nanoparticelle di ossido di ferro. Alcune combinazioni hanno mostrato un leggero aumento nello sviluppo dei noduli (ma non statisticamente significativo) a concentrazioni più elevate di kinetina e/o nanoparticelle di ossido di ferro, come la combinazione di 2,4-D (0,5–2 mg/L) con kinetina (1–1,5 mg/L) e nanoparticelle di ossido di ferro (2–4 mg/L). Questi risultati sono mostrati nella Figura 2. I noduli neri rappresentano ghiandole ricche di ipericina, presenti sia naturalmente che benefiche. In questo studio, i noduli neri erano principalmente associati all'imbrunimento dei tessuti, indicando un ambiente favorevole all'accumulo di ipericina. Il trattamento con 2,4-D, kinetina e nanoparticelle di Fe₃O₄ ha promosso la crescita del callo, ridotto l'imbrunimento e aumentato il contenuto di clorofilla, suggerendo una migliore funzione metabolica e una potenziale riduzione del danno ossidativo [37]. Questo studio ha valutato gli effetti della kinetina in combinazione con 2,4-D e nanoparticelle di Fe₃O₄ sulla crescita e lo sviluppo del callo di iperico (Fig. 3a–g). Studi precedenti hanno dimostrato che le nanoparticelle di Fe₃O₄ hanno attività antifungine e antimicrobiche [38, 39] e, se utilizzate in combinazione con regolatori della crescita delle piante, possono stimolare i meccanismi di difesa delle piante e ridurre gli indici di stress cellulare [18]. Sebbene la biosintesi dei metaboliti secondari sia regolata geneticamente, la loro resa effettiva dipende fortemente dalle condizioni ambientali. I cambiamenti metabolici e morfologici possono influenzare i livelli di metaboliti secondari regolando l'espressione di specifici geni vegetali e rispondendo ai fattori ambientali. Inoltre, gli induttori possono innescare l'attivazione di nuovi geni, che a loro volta stimolano l'attività enzimatica, attivando in definitiva molteplici vie biosintetiche e portando alla formazione di metaboliti secondari. Un altro studio ha inoltre dimostrato che la riduzione dell'ombreggiamento aumenta l'esposizione alla luce solare, innalzando così le temperature diurne nell'habitat naturale di *Hypericum perforatum*, il che contribuisce anche ad aumentare la resa di ipericina. Sulla base di questi dati, il presente studio ha indagato il ruolo delle nanoparticelle di ferro come potenziali induttori nella coltura tissutale. I risultati hanno mostrato che queste nanoparticelle possono attivare i geni coinvolti nella biosintesi dell'esperidina attraverso la stimolazione enzimatica, portando a un maggiore accumulo di questo composto (Fig. 2). Pertanto, rispetto alle piante che crescono in condizioni naturali, si può affermare che la produzione di tali composti in vivo può essere aumentata anche quando uno stress moderato si combina con l'attivazione dei geni coinvolti nella biosintesi dei metaboliti secondari. I trattamenti combinati hanno generalmente un effetto positivo sul tasso di rigenerazione, ma in alcuni casi questo effetto è indebolito. In particolare, il trattamento con 1 mg/L di 2,4-D, 1,5 mg/L di chinasi e diverse concentrazioni potrebbero aumentare in modo indipendente e significativo il tasso di rigenerazione del 50,85% rispetto al gruppo di controllo (Fig. 4c). Questi risultati suggeriscono che specifiche combinazioni di nanoormoni possono agire sinergicamente per promuovere la crescita delle piante e la produzione di metaboliti, il che è di grande importanza per la coltura tissutale di piante medicinali. Palmer e Keller [50] hanno dimostrato che il trattamento con 2,4-D potrebbe indurre in modo indipendente la formazione di callo in St. perforatum, mentre l'aggiunta di chinasi ha migliorato significativamente la formazione di callo e la rigenerazione. Questo effetto era dovuto al miglioramento dell'equilibrio ormonale e alla stimolazione della divisione cellulare. Bal et al. [51] hanno scoperto che il trattamento con Fe₃O₄-NP potrebbe migliorare in modo indipendente la funzione degli enzimi antiossidanti, promuovendo così la crescita delle radici in St. perforatum. I terreni di coltura contenenti nanoparticelle di Fe₃O₄ a concentrazioni di 0,5 mg/L, 1 mg/L e 1,5 mg/L hanno migliorato il tasso di rigenerazione delle piante di lino [52]. L'uso di kinetina, 2,4-diclorobenzotiazolinone e nanoparticelle di Fe₃O₄ ha migliorato significativamente i tassi di formazione di callo e radice, tuttavia, è necessario considerare i potenziali effetti collaterali dell'uso di questi ormoni per la rigenerazione in vitro. Ad esempio, l'uso a lungo termine o ad alta concentrazione di 2,4-diclorobenzotiazolinone o kinetina può provocare variazioni clonali somatiche, stress ossidativo, morfologia anomala del callo o vetrificazione. Pertanto, un alto tasso di rigenerazione non predice necessariamente la stabilità genetica. Tutte le piante rigenerate dovrebbero essere valutate utilizzando marcatori molecolari (ad esempio RAPD, ISSR, AFLP) o analisi citogenetica per determinarne l'omogeneità e la somiglianza con le piante in vivo [53,54,55].
Questo studio ha dimostrato per la prima volta che l'uso combinato di regolatori della crescita delle piante (2,4-D e chinetina) con nanoparticelle di Fe₃O₄ può migliorare la morfogenesi e l'accumulo di metaboliti bioattivi chiave (tra cui ipericina e iperoside) in *Hypericum perforatum*. Il regime di trattamento ottimizzato (1 mg/L di 2,4-D + 1 mg/L di chinetina + 4 mg/L di Fe₃O₄-NP) non solo ha massimizzato la formazione di callo, l'organogenesi e la resa di metaboliti secondari, ma ha anche dimostrato un lieve effetto induttore, migliorando potenzialmente la tolleranza allo stress e il valore medicinale della pianta. La combinazione di nanotecnologia e coltura di tessuti vegetali fornisce una piattaforma sostenibile ed efficiente per la produzione in vitro su larga scala di composti medicinali. Questi risultati aprono la strada ad applicazioni industriali e a future ricerche sui meccanismi molecolari, l'ottimizzazione del dosaggio e la precisione genetica, collegando così la ricerca fondamentale sulle piante medicinali con la biotecnologia pratica.
Data di pubblicazione: 12-12-2025