Il farmaco antielmintico N,N-dietil-m-toluamide (DEET) è stato segnalato per inibire l'AChE (acetilcolinesterasi) e ha potenziali proprietà cancerogene a causa dell'eccessiva vascolarizzazione. In questo articolo, dimostriamo che il DEET stimola specificamente le cellule endoteliali che promuovono l'angiogenesi, aumentando così la crescita tumorale. Il DEET attiva i processi cellulari che portano all'angiogenesi, tra cui proliferazione, migrazione e adesione. Ciò è associato a un aumento della produzione di NO e dell'espressione di VEGF nelle cellule endoteliali. Il silenziamento di M3 o l'uso di inibitori farmacologici di M3 ha abolito tutti questi effetti, suggerendo che l'angiogenesi indotta da DEET è sensibile a M3. Esperimenti che coinvolgono la segnalazione del calcio nelle cellule endoteliali e HEK che sovraesprimono i recettori M3, così come studi di legame e docking, indicano che il DEET agisce come un modulatore allosterico dei recettori M3. Inoltre, il DEET inibisce l'AChE, aumentando così la biodisponibilità dell'acetilcolina e il suo legame ai recettori M3 e potenziando gli effetti proangiogenici attraverso la regolazione allosterica.
Le cellule endoteliali primarie sono state isolate dall'aorta di topi svizzeri. Il metodo di estrazione è stato adattato dal protocollo Kobayashi 26. Le cellule endoteliali murine sono state coltivate in terreno di coltura EBM-2 arricchito con il 5% di FBS inattivato termicamente fino al quarto passaggio.
L'effetto di due concentrazioni di DEET sulla proliferazione di HUVEC, U87MG o BF16F10 è stato analizzato utilizzando il kit CyQUANT Cell Proliferation Assay (Molecular Probes, C7026). In breve, 5.103 cellule per pozzetto sono state seminate in una piastra a 96 pozzetti, lasciate aderire per una notte e quindi trattate con DEET per 24 ore. Dopo aver rimosso il terreno di coltura, è stata aggiunta la soluzione legante il colorante a ciascun pozzetto della micropiastra e le cellule sono state incubate a 37 °C per 30 minuti. I livelli di fluorescenza sono stati determinati utilizzando un lettore di micropiastre multimodale Mithras LB940 (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Germania) dotato di filtri di eccitazione a 485 nm e filtri di emissione a 530 nm.
Le cellule HUVEC sono state seminate in piastre da 96 pozzetti a una densità di 104 cellule per pozzetto. Le cellule sono state trattate con DEET per 24 ore. La vitalità cellulare è stata valutata utilizzando un saggio colorimetrico MTT (Sigma-Aldrich, M5655). I valori di densità ottica sono stati ottenuti su un lettore di micropiastre multimodale (Mithras LB940) a una lunghezza d'onda di 570 nm.
Gli effetti del DEET sono stati studiati utilizzando saggi di angiogenesi in vitro. Il trattamento con DEET 10-8 M o 10-5 M ha aumentato la formazione di lunghezza capillare negli HUVEC (Fig. 1a, b, barre bianche). Rispetto al gruppo di controllo, il trattamento con concentrazioni di DEET comprese tra 10-14 e 10-5 M ha mostrato che la lunghezza capillare ha raggiunto un plateau a 10-8 M di DEET (Fig. S2 supplementare). Non è stata riscontrata alcuna differenza significativa nell'effetto proangiogenico in vitro degli HUVEC trattati con DEET nell'intervallo di concentrazione di 10-8 M e 10-5 M.
Per determinare l'effetto del DEET sulla neovascolarizzazione, abbiamo condotto studi di neovascolarizzazione in vivo. Dopo 14 giorni, i topi iniettati con cellule endoteliali precoltivate con 10-8 M o 10-5 M di DEET hanno mostrato un aumento significativo del contenuto di emoglobina (Fig. 1c, barre bianche).
Inoltre, la neovascolarizzazione indotta da DEET è stata studiata in topi portatori di xenotrapianto U87MG a cui è stata iniettata quotidianamente (ip) DEET a una dose nota per indurre concentrazioni plasmatiche di 10-5 M, che è normale negli esseri umani esposti. in 23. Tumori rilevabili (ovvero tumori >100 mm3) sono stati osservati 14 giorni dopo l'iniezione di cellule U87MG nei topi. Al giorno 28, la crescita tumorale era significativamente aumentata nei topi trattati con DEET rispetto ai topi di controllo (Fig. 1d, quadrati). Inoltre, la colorazione con CD31 dei tumori ha mostrato che DEET aumentava significativamente l'area capillare ma non la densità dei microvasi. (Fig. 1e–g).
Per determinare il ruolo dei recettori muscarinici nella proliferazione indotta da DETA, sono stati utilizzati 10-8 M o 10-5 M di DETA in presenza di pFHHSiD (10-7 M, un antagonista selettivo del recettore M3). Il trattamento di HUVEC ha mostrato che pFHHSiD bloccava completamente le proprietà proliferative di DETA a tutte le concentrazioni (Tabella 1).
In queste condizioni, abbiamo anche esaminato se il DEET potesse aumentare la lunghezza dei capillari nelle cellule HUVEC. Analogamente, il pFHHSiD ha prevenuto significativamente la lunghezza dei capillari indotta dal DEET (Fig. 1a, b, barre grigie). Inoltre, esperimenti simili sono stati condotti con siRNA M3. Sebbene il siRNA di controllo non fosse efficace nel promuovere la formazione dei capillari, il silenziamento del recettore muscarinico M3 ha abolito la capacità del DEET di aumentare la lunghezza dei capillari (Fig. 1a, b, barre nere).
Inoltre, sia la vascolarizzazione in vitro (10-8 M o 10-5 M) indotta da DEET, sia la neovascolarizzazione in vivo sono state completamente bloccate da pFHHSiD (Fig. 1c, d, cerchi). Questi risultati indicano che il DEET promuove l'angiogenesi attraverso un pathway sensibile agli antagonisti selettivi del recettore M3 o al siRNA M3.
L'AChE è il bersaglio molecolare del DEET. Farmaci come il donepezil, che agiscono come inibitori dell'AChE, possono stimolare l'angiogenesi delle cellule endoteliali (EC) in vitro e in modelli murini di ischemia degli arti posteriori14. Abbiamo testato l'effetto di due concentrazioni di DEET sull'attività enzimatica dell'AChE nelle cellule endoteliali (HUVEC). Concentrazioni basse (10-8 M) e alte (10-5 M) di DEET hanno ridotto l'attività dell'AChE endoteliale rispetto alle condizioni di controllo (Fig. 2).
Entrambe le concentrazioni di DEET (10-8 M e 10-5 M) hanno ridotto l'attività dell'acetilcolinesterasi sulle cellule HUVEC. BW284c51 (10-5 M) è stato utilizzato come controllo per gli inibitori dell'acetilcolinesterasi. I risultati sono espressi come percentuale di attività dell'AChE sulle cellule HUVEC trattate con le due concentrazioni di DEET rispetto alle cellule trattate con il veicolo. I valori sono espressi come media ± SEM di sei esperimenti indipendenti. *p < 0,05 rispetto al controllo (test di confronto multiplo di Kruskal-Wallis e Dunn).
L'ossido nitrico (NO) è coinvolto nel processo angiogenico 33, pertanto è stata studiata la produzione di NO nelle cellule HUVEC stimolate con DEET. La produzione endoteliale di NO trattata con DEET è risultata aumentata rispetto alle cellule di controllo, ma ha raggiunto significatività solo a una dose di 10-8 M (Fig. 3c). Per determinare i cambiamenti molecolari che controllano la produzione di NO indotta da DEET, l'espressione e l'attivazione di eNOS sono state analizzate mediante Western blotting. Sebbene il trattamento con DEET non abbia alterato l'espressione di eNOS, ha aumentato significativamente la fosforilazione di eNOS nel suo sito di attivazione (Ser-1177) riducendone al contempo il sito inibitorio (Thr-495) rispetto alle cellule non trattate nella fosforilazione di eNOS (Fig. 3d). Inoltre, il rapporto tra eNOS fosforilata nel sito di attivazione e nel sito inibitorio è stato calcolato dopo aver normalizzato la quantità di eNOS fosforilata rispetto alla quantità totale di enzima. Questo rapporto è aumentato significativamente nelle cellule HUVEC trattate con ciascuna concentrazione di DEET rispetto alle cellule non trattate (Fig. 3d).
Infine, l'espressione di VEGF, uno dei principali fattori proangiogenici, è stata analizzata mediante Western blotting. Il DEET ha aumentato significativamente l'espressione di VEGF, mentre il pFHHSiD l'ha completamente bloccata.
Poiché gli effetti del DEET sono sensibili sia al blocco farmacologico che alla downregulation dei recettori M3, abbiamo testato l'ipotesi che il DEET potesse migliorare la segnalazione del calcio. Sorprendentemente, il DEET non è riuscito ad aumentare il calcio citoplasmatico in HUVEC (dati non mostrati) e HEK/M3 (Fig. 4a, b) per entrambe le concentrazioni utilizzate.
Data di pubblicazione: 30-12-2024