Il farmaco antielmintico N,N-dietil-m-toluamide (DEETÈ stato riportato che il DEET inibisce l'AChE (acetilcolinesterasi) e possiede potenziali proprietà cancerogene a causa dell'eccessiva vascolarizzazione. In questo articolo, dimostriamo che il DEET stimola specificamente le cellule endoteliali che promuovono l'angiogenesi, aumentando così la crescita tumorale. Il DEET attiva processi cellulari che portano all'angiogenesi, tra cui proliferazione, migrazione e adesione. Ciò è associato a un aumento della produzione di NO e dell'espressione di VEGF nelle cellule endoteliali. Il silenziamento di M3 o l'uso di inibitori farmacologici di M3 hanno abolito tutti questi effetti, suggerendo che l'angiogenesi indotta dal DEET è sensibile a M3. Esperimenti che coinvolgono la segnalazione del calcio in cellule endoteliali e HEK che sovraesprimono i recettori M3, così come studi di legame e docking, indicano che il DEET agisce come un modulatore allosterico dei recettori M3. Inoltre, il DEET inibisce l'AChE, aumentando così la biodisponibilità dell'acetilcolina e il suo legame ai recettori M3, e potenziando gli effetti proangiogenici attraverso la regolazione allosterica.
Le cellule endoteliali primarie (EC) sono state isolate dall'aorta di topi svizzeri. Il metodo di estrazione è stato adattato dal protocollo di Kobayashi 26. Le cellule endoteliali murine sono state coltivate in terreno EBM-2 supplementato con il 5% di siero fetale bovino (FBS) inattivato termicamente fino al quarto passaggio.
L'effetto di due concentrazioni di DEET sulla proliferazione di cellule HUVEC, U87MG o BF16F10 è stato analizzato utilizzando il kit CyQUANT Cell Proliferation Assay (Molecular Probes, C7026). In breve, 5 x 10³ cellule per pozzetto sono state seminate in una piastra a 96 pozzetti, lasciate aderire per una notte e quindi trattate con DEET per 24 ore. Dopo aver rimosso il terreno di coltura, è stata aggiunta la soluzione legante il colorante a ciascun pozzetto della micropiastra e le cellule sono state incubate a 37 °C per 30 minuti. I livelli di fluorescenza sono stati determinati utilizzando un lettore di micropiastre multimodale Mithras LB940 (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Germania) dotato di filtri di eccitazione a 485 nm e filtri di emissione a 530 nm.
Le cellule HUVEC sono state seminate in piastre a 96 pozzetti a una densità di 10⁴ cellule per pozzetto. Le cellule sono state trattate con DEET per 24 ore. La vitalità cellulare è stata valutata mediante un test colorimetrico MTT (Sigma-Aldrich, M5655). I valori di densità ottica sono stati ottenuti con un lettore di micropiastre multimodale (Mithras LB940) a una lunghezza d'onda di 570 nm.
Gli effetti del DEET sono stati studiati utilizzando saggi di angiogenesi in vitro. Il trattamento con 10⁻⁸ M o 10⁻⁵ M di DEET ha aumentato la formazione di capillari nelle cellule HUVEC (Fig. 1a, b, barre bianche). Rispetto al gruppo di controllo, il trattamento con concentrazioni di DEET comprese tra 10⁻¹⁴ e 10⁻⁵ M ha mostrato che la lunghezza dei capillari ha raggiunto un plateau a 10⁻⁸ M di DEET (Figura supplementare S2). Non è stata riscontrata alcuna differenza significativa nell'effetto proangiogenico in vitro delle cellule HUVEC trattate con DEET nell'intervallo di concentrazione di 10⁻⁸ M e 10⁻⁵ M.
Per determinare l'effetto del DEET sulla neovascolarizzazione, abbiamo condotto studi di neovascolarizzazione in vivo. Dopo 14 giorni, i topi a cui erano state iniettate cellule endoteliali precoltivate con 10⁻⁸ M o 10⁻⁵ M di DEET hanno mostrato un aumento significativo del contenuto di emoglobina (Fig. 1c, barre bianche).
Inoltre, la neovascolarizzazione indotta da DEET è stata studiata in topi portatori di xenotrapianti U87MG a cui è stato iniettato quotidianamente (ip) DEET a una dose nota per indurre concentrazioni plasmatiche di 10⁻⁵ M, che è normale negli esseri umani esposti. In 23. Tumori rilevabili (cioè tumori >100 mm³) sono stati osservati 14 giorni dopo l'iniezione di cellule U87MG nei topi. Al giorno 28, la crescita del tumore è risultata significativamente aumentata nei topi trattati con DEET rispetto ai topi di controllo (Fig. 1d, quadrati). Inoltre, la colorazione con CD31 dei tumori ha mostrato che il DEET ha aumentato significativamente l'area capillare ma non la densità dei microvasi (Fig. 1e-g).
Per determinare il ruolo dei recettori muscarinici nella proliferazione indotta da DETA, è stato utilizzato DETA a concentrazioni di 10⁻⁸ M o 10⁻⁵ M in presenza di pFHHSiD (10⁻⁷ M, un antagonista selettivo del recettore M3). Il trattamento delle cellule HUVEC con pFHHSiD ha bloccato completamente le proprietà proliferative del DETA a tutte le concentrazioni (Tabella 1).
In queste condizioni, abbiamo anche esaminato se il DEET potesse aumentare la lunghezza dei capillari nelle cellule HUVEC. Analogamente, pFHHSiD ha impedito in modo significativo l'aumento della lunghezza dei capillari indotto dal DEET (Fig. 1a, b, barre grigie). Inoltre, esperimenti simili sono stati condotti con siRNA M3. Sebbene il siRNA di controllo non fosse efficace nel promuovere la formazione di capillari, il silenziamento del recettore muscarinico M3 ha abolito la capacità del DEET di aumentare la lunghezza dei capillari (Fig. 1a, b, barre nere).
Inoltre, sia la vascolarizzazione indotta da DEET a concentrazioni di 10⁻⁸ M o 10⁻⁵ M in vitro, sia la neovascolarizzazione in vivo sono state completamente bloccate da pFHHSiD (Fig. 1c, d, cerchi). Questi risultati indicano che il DEET promuove l'angiogenesi attraverso una via sensibile agli antagonisti selettivi del recettore M3 o all'siRNA per M3.
L'AChE è il bersaglio molecolare del DEET. Farmaci come il donepezil, che agiscono come inibitori dell'AChE, possono stimolare l'angiogenesi delle cellule endoteliali in vitro e in modelli di ischemia degli arti posteriori del topo14. Abbiamo testato l'effetto di due concentrazioni di DEET sull'attività enzimatica dell'AChE nelle cellule HUVEC. Basse (10⁻⁸ M) e alte (10⁻⁵ M) concentrazioni di DEET hanno ridotto l'attività dell'AChE endoteliale rispetto alle condizioni di controllo (Fig. 2).
Entrambe le concentrazioni di DEET (10⁻⁸ M e 10⁻⁵ M) hanno ridotto l'attività dell'acetilcolinesterasi sulle cellule HUVEC. Il BW284c51 (10⁻⁵ M) è stato utilizzato come controllo per gli inibitori dell'acetilcolinesterasi. I risultati sono espressi come percentuale dell'attività dell'AChE sulle cellule HUVEC trattate con le due concentrazioni di DEET rispetto alle cellule trattate con il veicolo. I valori sono espressi come media ± SEM di sei esperimenti indipendenti. *p < 0,05 rispetto al controllo (test di confronto multiplo di Kruskal-Wallis e Dunn).
L'ossido nitrico (NO) è coinvolto nel processo angiogenico 33, pertanto è stata studiata la produzione di NO nelle HUVEC stimolate con DEET. La produzione di NO endoteliale trattata con DEET è risultata aumentata rispetto alle cellule di controllo, ma ha raggiunto la significatività solo a una dose di 10⁻⁸ M (Fig. 3c). Per determinare i cambiamenti molecolari che controllano la produzione di NO indotta da DEET, l'espressione e l'attivazione di eNOS sono state analizzate mediante Western blotting. Sebbene il trattamento con DEET non abbia alterato l'espressione di eNOS, ha aumentato significativamente la fosforilazione di eNOS nel suo sito di attivazione (Ser-1177) diminuendo al contempo il suo sito inibitorio (Thr-495) rispetto alle cellule non trattate nella fosforilazione di eNOS (Fig. 3d). Inoltre, il rapporto tra eNOS fosforilata nel sito di attivazione e nel sito inibitorio è stato calcolato dopo aver normalizzato la quantità di eNOS fosforilata rispetto alla quantità totale di enzima. Questo rapporto è risultato significativamente aumentato nelle cellule HUVEC trattate con ciascuna concentrazione di DEET rispetto alle cellule non trattate (Fig. 3d).
Infine, l'espressione del VEGF, uno dei principali fattori proangiogenici, è stata analizzata mediante Western blotting. Il DEET ha aumentato significativamente l'espressione del VEGF, mentre il pFHHSiD ha bloccato completamente tale espressione.
Poiché gli effetti del DEET sono sensibili sia al blocco farmacologico che alla downregulation dei recettori M3, abbiamo testato l'ipotesi che il DEET potesse potenziare la segnalazione del calcio. Sorprendentemente, il DEET non è riuscito ad aumentare il calcio citoplasmatico nelle cellule HUVEC (dati non mostrati) e HEK/M3 (Fig. 4a, b) per entrambe le concentrazioni utilizzate.
Data di pubblicazione: 30 dicembre 2024