I pesticidi svolgono un ruolo fondamentale nell'affrontare la carenza alimentare globale e nel combattere le malattie umane trasmesse da vettori. Tuttavia, il crescente problema della resistenza ai pesticidi richiede urgentemente la scoperta di nuovi composti che agiscano su bersagli sottoutilizzati. I canali del potenziale recettore transitorio (TRPV) degli insetti, Nanzhong (Nan) e inattivo (Iav), possono formare canali eterologhi (Nan-Iav) e localizzarsi negli organi meccanocettori che mediano il geotropismo, l'udito e la propriocezione negli insetti. Alcuni pesticidi, come l'afidopirrolidone (AP), agiscono su Nan-Iav attraverso meccanismi ancora sconosciuti. L'AP è efficace contro gli insetti pungenti-succhiatori (emitteri), impedendone l'alimentazione interrompendo la funzione dei filamenti. L'AP può legarsi solo a Nan, ma solo Nan-Iav può interagire con gli agonisti, tra cui la nicotinamide endogena (NAM), manifestando così attività di canale. Nonostante il potenziale di Nan-Iav come bersaglio per gli insetticidi, si sa poco sull'assemblaggio del suo canale, sui siti di legame regolatori e sulla regolazione dipendente dal Ca2+, il che ostacola l'ulteriore sviluppo di insetticidi. In questo studio, la microscopia crioelettronica è stata utilizzata per determinare la struttura di Nan-Iav negli insetti Emitteri allo stato privo di ligando calmodulina, nonché con AP e NAM al confine del dominio citoplasmatico a ripetizione di ankirina (ARD). Sorprendentemente, abbiamo scoperto che la proteina Nan stessa può formare un pentamero, che viene stabilizzato dalle interazioni ARD mediate da AP. Questo studio rivela le interazioni molecolari tra insetticidi e agonisti e Nan-Iav, evidenziando l'importanza dell'ARD nella funzione e nell'assemblaggio del canale ed esplorando il meccanismo di regolazione del Ca2+.
Nel contesto di un cambiamento climatico globale sempre più grave, il deterioramento della sicurezza alimentare mondiale rappresenta una delle principali sfide del XXI secolo, con conseguenze a cascata per la società.1,2Il rapporto SOFI (State of Food Security and Nutrition in the World 2023) dell'Organizzazione Mondiale della Sanità stima che circa 2,33 miliardi di persone in tutto il mondo soffrano di insicurezza alimentare da moderata a grave, un problema di lunga data.3,4Purtroppo, si stima che dal 20% al 30% o più del raccolto vada perso ogni anno a causa di parassiti e agenti patogeni, e si prevede che il riscaldamento globale aggraverà la resistenza dei parassiti e la vulnerabilità delle colture.4,5,6,7,8Lo sviluppo di pesticidi è fondamentale non solo per proteggere le colture dai parassiti e ridurre la diffusione di agenti patogeni trasmessi da vettori, ma anche per combattere le malattie umane trasmesse da vettori, come la dengue, la malaria e la malattia di Chagas, che stanno diventando sempre più resistenti ai pesticidi.5,9,10,11
Tra i principali bersagli degli insetticidi neurotossici, il canale eterotetramerica TRPV Nanchung (Nan)-Inattivo (Iav) rappresenta una classe di bersagli degli insetticidi scoperti solo nell'ultimo decennio, tra cui insetticidi disponibili in commercio come l'imidacloprid e la piraclostrobina.12,13,14L'insetticida semisintetico afidopirrolifene (AP) è un prodotto recentemente sviluppato e commercializzato, il cui componente principale è l'insetticida attivo Inscalis®, che lega l'AP a un livello di attività subnanomolare.15L'AP presenta una bassa tossicità acuta per gli impollinatori, gli insetti utili e altri organismi non bersaglio e, se utilizzato secondo le istruzioni riportate sull'etichetta, può ridurre la pressione di resistenza ad altri insetticidi.16,17,18Nan e Iav sono ampiamente distribuiti tra le specie di insetti, sono co-espressi solo nei neuroni recettoriali dello stiramento cordale delle antenne e degli arti e sono essenziali per l'udito, la percezione della gravità e la propriocezione.13,16,19,20,21,22AP, imidacloprid e piraclostrobin stimolano il complesso Nan-Iav attraverso un meccanismo unico, inibendo in definitiva la trasduzione del segnale propriocettivo.13,16,23Negli insetti pungenti-succhiatori (emitteri) come afidi e mosche bianche, la perdita della propriocezione compromette la loro capacità di nutrirsi, portando infine alla morte.13,24È interessante notare che AP mostra un'elevata affinità per il complesso Nan-Iav e una bassa affinità per Nan da solo. Il legame di AP a Nan-Iav induce una corrente elettrica, ma il legame a Nan da solo non stimola l'attività del canale. Iav da solo non si lega affatto ad AP.16Ciò suggerisce che Nan e Iav possano legarsi per formare diversi complessi di canali Nan-Iav (ad esempio, con diversi rapporti stechiometrici o diverse disposizioni all'interno dello stesso rapporto stechiometrico) o che l'AP possa legarsi a più siti. Inoltre, l'agonista naturale nicotinamide (NAM) si lega a Nan-Iav di Drosophila con affinità micromolare, mostrando effetti simili a quelli degli afidi (AP) in vitro.16,25e inibendo la riproduzione e l'alimentazione degli afidi, portando infine alla loro morte.25,26Questi dati sollevano molti interrogativi. Ad esempio, non è ancora chiaro come si formi l'eterodimero Nan-Iav, quali siti di legame siano utilizzati per modulare le piccole molecole e come queste regolino la funzione del canale sopprimendo la propriocezione. Inoltre, non sono ancora chiare le ragioni per cui Nan stesso sia inattivo e abbia una bassa affinità per l'AP, mentre l'eterodimero Nan-Iav è attivo e lega l'AP con maggiore affinità. Infine, si sa ancora poco sulla regolazione Ca2+-dipendente della funzione di Nan-Iav e su come questa sia integrata nei processi di segnalazione neuronale.. 13,21
In questo studio, combinando la microscopia crioelettronica, l'elettrofisiologia e le tecniche di legame con radioligandi, abbiamo chiarito l'assemblaggio di Nan-Iav e il meccanismo del suo legame con regolatori a piccole molecole. Inoltre, abbiamo rilevato la calmodulina (CaM) legata in modo costitutivo a Iav e i pentameri di Nan stabilizzati da AP. Questi risultati forniscono importanti informazioni sulla regolazione degli ioni calcio nei canali, sull'assemblaggio dei canali e sui fattori che determinano l'affinità di legame del ligando. Ancora più importante, abbiamo confermato che ARD svolge un ruolo centrale in questi processi. Il nostro studio sui canali completi degli insetti legati a pesticidi agricoli rilevanti27, 28, 29Ciò apre nuove prospettive per lo sviluppo dell'industria dei pesticidi, migliorando l'efficacia e la specificità dei prodotti e consentendo l'applicazione di composti mirati al TRPV ad altre specie, al fine di affrontare la sicurezza alimentare globale e la diffusione delle malattie trasmesse da vettori.
Abbiamo inoltre scoperto che Nan-Iav è regolato dal Ca2+ e che il meccanismo di regolazione è mediato dalla CaM legata in modo costitutivo. È importante sottolineare che questa regolazione di Nav dipendente dal Ca2+ da parte della CaM differisce significativamente dai meccanismi di regolazione di altri canali ionici (ad esempio, i canali del Na+ voltaggio-dipendenti e i canali TRPV5/6).52,53,54,55,56,57Nel canale Nav1.2, il dominio C-terminale della CaM si associa elicoidalmente al dominio C-terminale (CTD) e il Ca2+ induce il legame del suo dominio N-terminale alla porzione distale del CTD.56Nel canale TRPV5/6, il dominio C-terminale della CaM si lega al CTH e il Ca2+ induce l'estensione verso l'alto del suo dominio N-terminale nel poro, bloccando così la permeabilità ai cationi.53,54Proponiamo un modello per la funzione regolata dal Ca2+ del complesso Nan-Iav-CaM (Fig. 4h). In questo modello, il dominio N-terminale della CaM si lega costitutivamente al dominio C-terminale (CTH) di Iav. Nello stato di riposo (bassa concentrazione di [Ca2+]), il dominio C-terminale della CaM interagisce con Nan, stabilizzando la conformazione ARD e promuovendo così l'apertura del canale. Il legame di un agonista/insetticida al canale induce l'apertura del poro, con conseguente afflusso di Ca2+. Il Ca2+ si lega quindi alla CaM, causando la dissociazione del dominio C-terminale dall'ARD di Nan. Poiché il blocco del legame della CaM abolisce essenzialmente l'effetto inibitorio del Ca2+, questa dissociazione modula la mobilità dell'ARD, causando così un'inibizione o desensibilizzazione calcio-dipendente. Il rapido recupero delle correnti del canale dopo l'eluizione degli ioni calcio (Fig. 4g) suggerisce che questo meccanismo faciliti risposte rapide ai segnali neuronali mediati dal Ca2+. Inoltre, è stato riportato che la regione C-terminale di Iav, che rimane ancora poco compresa, svolge altri ruoli nel targeting del canale e nella regolazione della corrente.21
Infine, il nostro studio presenta la struttura ad alta risoluzione di un complesso canale TRP insetticida-insetticida di importanza agricola, una scoperta a noi finora sconosciuta. In particolare, abbiamo caratterizzato la struttura e la funzione del canale dell'insetto in cellule umane (HEK293S GnTi–) anziché in cellule di insetto. Di fronte alla crescente resistenza agli insetticidi e alla continua pressione sulla sicurezza alimentare e sugli agenti patogeni, il nostro lavoro fornisce informazioni importanti che faciliteranno lo sviluppo di nuovi insetticidi a beneficio della salute umana e della sicurezza alimentare globale. Studi hanno dimostrato che insetticidi come l'AP sono efficaci contro alcuni parassiti se utilizzati secondo le istruzioni riportate sull'etichetta e presentano una bassa tossicità acuta per gli impollinatori utili, dimostrandone la sicurezza ambientale.13,16Inoltre, i test di alcuni derivati AP sulle zanzare hanno dimostrato che alla fine perdono la capacità di volare. Comprendere come questi composti modulatori si legano a Nan-Iav faciliterà la modifica dei composti esistenti o lo sviluppo di nuovi composti per una maggiore efficacia eprecisocontrollo dei parassiti. Il nostro studio dimostra che l'interfaccia Nan-Iav ARD è fondamentale non solo per regolare l'attività di composti endogeni, pesticidi e Ca2+-CaM, ma anche per l'assemblaggio del canale. Suggeriamo che interrompere l'assemblaggio dell'eterodimero con piccole molecole possa essere un approccio unico e promettente per lo sviluppo di inibitori dei canali ionici.
Degli otto geni ortologhi, sono stati selezionati i geni a lunghezza intera del coleottero bruno (Halyomorpha halys) Nanchung e Inactive, che mostrano un'eccellente stabilità nei detergenti. I geni sintetizzati sono stati ottimizzati per l'espressione umana e clonati nel vettore pBacMam pCMV-DEST (Life Technologies) utilizzando i siti di restrizione XhoI ed EcoRI. Ciò ha garantito che i cloni fossero in fase con i tag C-terminali GFP-FLAG-10xHis e mCherry-FLAG-10xHis, che vengono scissi dalla proteasi HRC-3C (PPX), consentendo l'espressione indipendente.espressioneI primer utilizzati per clonare Nanchung e Inactive nel vettore pBacMam erano i seguenti:
Le immagini microscopiche delle singole particelle sono state ottenute con un microscopio elettronico a trasmissione Titan Krios G2 (FEI) dotato di una telecamera K3 e di un filtro energetico Gatan BioQuantum. Il microscopio è stato utilizzato a 300 keV, con un'impostazione energetica di 20 eV, una dimensione del pixel del campione di 1,08 Å/pixel (ingrandimento nominale di 81.000x) e un gradiente di defocus compreso tra -0,8 e -2,2 μm. La registrazione video è stata effettuata a 40 fotogrammi al secondo utilizzando un microscopio Latitude S (Gatan) con una dose rate nominale di 25 e–px−1 s−1, un tempo di esposizione di 2,4 s e una dose totale di circa 60 e–Å−2.
La correzione del movimento indotto dal fascio e la ponderazione della dose sono state eseguite su pellicola utilizzando MotionCor2 in RELION 4.061. La stima del parametro della funzione di trasferimento del contrasto (CTF) è stata eseguita in cryoSPARC utilizzando il metodo di stima CTF basato su patch62. Le microfotografie con una risoluzione di adattamento CTF ≥4 Å sono state escluse dall'analisi successiva. In genere, un sottoinsieme di 500-1000 microfotografie è stato utilizzato per la selezione dei punti in cryoSPARC, seguito da diversi cicli di classificazione 2D dopo il filtraggio per ottenere un'immagine di riferimento chiara per la selezione delle particelle basata sul modello. Le particelle sono state quindi estratte utilizzando bounding box da 64 pixel e binning a 4 livelli. Sono stati eseguiti diversi cicli di classificazione 2D per rimuovere le categorie di particelle indesiderate. Il modello 3D iniziale è stato ricostruito utilizzando la ricostruzione ab initio e perfezionato utilizzando il raffinamento non uniforme in cryoSPARC. La classificazione 3D è stata eseguita in cryoSPARC o RELION in base all'eterogeneità ARD. Non è stata osservata alcuna eterogeneità significativa dei domini di membrana. Le particelle sono state raffinate utilizzando i metodi C1 e C2; le particelle con risoluzione C2 più elevata sono state considerate simmetriche rispetto a C2 e importate in RELION per il raffinamento bayesiano. Le particelle sono state quindi trasferite nuovamente in cryoSPARC per il raffinamento finale non uniforme e locale. La risoluzione finale e il conteggio delle particelle sono mostrati nella Tabella 1.
Durante la lavorazione dei pentameri Nan+AP, abbiamo esplorato diversi metodi per migliorare la risoluzione dei domini di membrana (in particolare la regione del poro), come la sottrazione del segnale e la mascheratura del TMD. Tuttavia, questi tentativi non hanno avuto successo a causa del potenziale estremo disordine nella regione del poro e dell'eterogeneità complessiva del TMD. La risoluzione finale è stata calcolata utilizzando una maschera generata automaticamente dal metodo di elaborazione non uniforme in cryoSPARC, mirata principalmente alla regione ARD. Ciò ha permesso di ottenere una risoluzione significativamente più elevata rispetto a quella dei domini di membrana (in particolare la regione VSLD).
I modelli de novo iniziali delle forme apo dei batteri Nanchung e Inactive sono stati inizialmente generati utilizzando Coot63, mentre i modelli dei batteri Nan e Iav sono stati generati utilizzando AlphaFold264 per identificare le regioni a bassa confidenza. La modellazione della calmodulina si è basata su adattamenti a corpo rigido dei modelli leganti e privi di Ca2+ nelle accessioni PDB 4JPZ56 e 1CFD65, rispettivamente. I modelli sono stati perfezionati utilizzando il raffinamento sferico per garantire la corretta stereochimica e una buona geometria. Fosfatidilcolina, fosfatidiletanolammina e fosfatidilserina sono state quindi modellate come densità lipidiche ben definite, e i ligandi NAM e AP sono stati posizionati nelle densità corrispondenti nelle giunzioni strette. I file di vincoli sono stati generati dalla stringa SMILES delle isoforme utilizzando eLBOW in PHENIX66. Infine, i modelli sono stati perfezionati nello spazio reale in PHENIX utilizzando la ricerca su griglia locale e la minimizzazione globale con vincoli di struttura secondaria. Il server MolProbity è stato utilizzato per il perfezionamento del modello e l'analisi strutturale, e le illustrazioni sono state eseguite utilizzando PyMOL e UCSF Chimera X. 67,68,69 L'analisi di apertura è stata eseguita utilizzando il server HOLE,70 e la mappatura della conservazione della sequenza è stata eseguita utilizzando il server Consurf.71
L'analisi statistica è stata eseguita utilizzando Igor Pro 6.2, Excel Office 365 e GraphPad Prism 7.0. Tutti i dati quantitativi sono presentati come media ± errore standard (SEM). Il test t di Student (a due code, non appaiato) è stato utilizzato per confrontare due gruppi. L'analisi della varianza a una via (ANOVA) seguita dal test post hoc di Dunnett è stata utilizzata per confrontare più gruppi. *P< 0,05, **P< 0,01 e ***PI valori di p < 0,001 sono stati considerati statisticamente significativi a seconda della distribuzione dei dati. I valori di Kd, Ki e i relativi intervalli di confidenza asimmetrici al 95% sono stati calcolati utilizzando GraphPad Prism 10.
Per maggiori dettagli sulla metodologia dello studio, si prega di consultare il riepilogo del Nature Portfolio Report, disponibile a questo link.
Il modello iniziale è stato costruito utilizzando i modelli di calmodulina dei database PDB 4JPZ e 1CFD. Le coordinate sono state depositate nel Protein Data Bank (PDB) con i numeri di accesso 9NVN (Nan-Iav-CaM senza ligando), 9NVO (Nan-Iav-CaM legato a nicotinamide), 9NVP (Nan-Iav-CaM legato a nicotinamide e EDTA), 9NVQ (Nan-Iav-CaM legato ad afenidolpirrolina e calcio), 9NVR (Nan-Iav-CaM legato ad afenidolpirrolina e EDTA) e 9NVS (pentamero di Nan legato ad afenidolpirrolina). Le corrispondenti immagini di criomicroscopia elettronica sono depositate nell'Electron Microscopy Database (EMDB) con i seguenti numeri di accesso: EMD-49844 (Nan-Iav-CaM senza ligando), EMD-49845 (complesso Nan-Iav-CaM con nicotinamide), EMD-49846 (complesso Nan-Iav-CaM con nicotinamide ed EDTA), EMD-49847 (complesso Nan-Iav-CaM con afidopirrolina e calcio), EMD-49848 (complesso Nan-Iav-CaM con afidopirrolina ed EDTA) ed EMD-49849 (complesso pentamero Nan con afidopirrolina). I dati grezzi per l'analisi funzionale sono presentati in questo articolo.
Data di pubblicazione: 28-01-2026