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La scoperta e l'uso benefico di prodotti naturali possono contribuire a migliorare la vita umana. Le sostanze chimiche inibitrici della crescita delle piante sono ampiamente utilizzate come erbicidi per il controllo delle erbe infestanti. Data la necessità di utilizzare diversi tipi di erbicidi, è necessario identificare composti con nuovi meccanismi d'azione. In questo studio, abbiamo scoperto un nuovo composto N-alcossipirrolico, la cumamonamide, da Streptomyces werraensis MK493-CF1 e ne abbiamo stabilito il processo di sintesi completo. Attraverso saggi di attività biologica, abbiamo scoperto che l'acido urs-monoammico è un intermedio sintetico dell'urs-monoammide e un potenzialeinibitore della crescita delle pianteInoltre, abbiamo sviluppato diversi derivati dell'acido urbenonico, tra cui il derivato urbenilossi (UDA), che possiede un'elevata attività erbicida senza influire negativamente sulla crescita delle cellule HeLa. Abbiamo inoltre scoperto che i derivati dell'acido urmotonico interrompono i microtubuli delle piante; inoltre, il KAND agisce sui filamenti di actina e induce la morte cellulare; questi effetti multiformi differiscono da quelli degli inibitori dei microtubuli noti e suggeriscono un nuovo meccanismo d'azione per l'acido ursonico, che rappresenta un importante vantaggio nello sviluppo di nuovi erbicidi.
La scoperta e l'applicazione pratica di prodotti naturali benefici e dei loro derivati rappresentano un mezzo per migliorare la qualità della vita umana. I metaboliti secondari prodotti da microrganismi, piante e insetti hanno portato a importanti progressi in medicina e agricoltura. Molti antibiotici e farmaci antileucemici sono stati sviluppati a partire da prodotti naturali. Inoltre, vari tipi dipesticidiDa questi prodotti naturali vengono estratti fungicidi ed erbicidi per l'uso in agricoltura. In particolare, gli erbicidi per il controllo delle erbe infestanti sono strumenti importanti per aumentare le rese delle colture nell'agricoltura moderna e vari tipi di composti sono già utilizzati commercialmente. Diversi processi cellulari nelle piante, come la fotosintesi, il metabolismo degli amminoacidi, la sintesi della parete cellulare, la regolazione della mitosi, la segnalazione dei fitormoni o la sintesi proteica, sono considerati tipici bersagli degli erbicidi. I composti che inibiscono la funzione dei microtubuli sono una classe comune di erbicidi che influenzano la crescita delle piante influenzando la regolazione mitotica2.
I microtubuli sono componenti del citoscheletro e sono ampiamente conservati nelle cellule eucariotiche. L'eterodimero di tubulina è costituito da α-tubulina e β-tubulina che formano protofilamenti lineari di microtubuli, con 13 protofilamenti che formano una struttura cilindrica. I microtubuli svolgono molteplici ruoli nelle cellule vegetali, tra cui la determinazione della forma cellulare, la divisione cellulare e il trasporto intracellulare3,4. Le cellule vegetali contengono microtubuli al di sotto della membrana plasmatica interfasica e si ritiene che questi cosiddetti microtubuli corticali controllino l'organizzazione delle microfibrille di cellulosa attraverso la regolazione dei complessi di cellulosa sintasi4,5. I microtubuli corticali delle cellule epidermiche della radice, presenti nella zona di rapido allungamento dell'apice radicale, sono situati lateralmente e le microfibre di cellulosa seguono questi microtubuli e limitano la direzione di espansione cellulare, promuovendo così l'allungamento cellulare anisotropo. Pertanto, la funzione dei microtubuli è strettamente correlata alla morfologia della pianta. Le sostituzioni amminoacidiche nei geni che codificano per la tubulina causano un'inclinazione della disposizione dei microtubuli corticali e una crescita obliqua sul lato sinistro o destro in Arabidopsis 6,7. Analogamente, mutazioni nelle proteine associate ai microtubuli che regolano la dinamica dei microtubuli possono anche portare a una crescita distorta delle radici 8,9,10,11,12,13. Inoltre, il trattamento con erbicidi che interferiscono con i microtubuli come la disopiramide, nota anche come pretilachlor, causa anche una crescita obliqua delle radici sul lato sinistro14. Questi dati indicano che una regolazione precisa della funzione dei microtubuli è fondamentale per determinare la direzione di crescita della pianta.
Sono stati scoperti vari tipi di inibitori dei microtubuli, e questi farmaci hanno apportato contributi significativi alla ricerca sul citoscheletro, nonché all'agricoltura e alla medicina2. In particolare, l'orizalina, i composti dinitroanilinici, la disopiramide, i composti correlati alla benzammide e i loro analoghi possono inibire la funzione dei microtubuli e quindi inibire la crescita delle piante. Pertanto, sono ampiamente utilizzati come erbicidi. Tuttavia, poiché i microtubuli sono una componente importante delle cellule vegetali e animali, la maggior parte degli inibitori dei microtubuli è citotossica per entrambi i tipi cellulari. Pertanto, nonostante la loro riconosciuta utilità come erbicidi, un numero limitato di agenti antimicrotubuli viene utilizzato per scopi pratici.
Streptomyces è un genere della famiglia Streptomyces, che comprende batteri filamentosi aerobi Gram-positivi ed è ampiamente noto per la sua capacità di produrre un'ampia gamma di metaboliti secondari. Pertanto, è considerato una delle fonti più importanti di nuovi prodotti naturali biologicamente attivi. Nel presente studio, abbiamo scoperto un nuovo composto chiamato cumamonamide, isolato da Streptomyces werraensis MK493-CF1 e S. werraensis ISP 5486. Utilizzando l'analisi spettrale e l'analisi spettrale completa, è stata caratterizzata la struttura della cumamonamide e ne è stato determinato il suo esclusivo scheletro N-alcossipirrolico. Sintesi. L'acido ursmonico, un intermedio sintetico dell'ursmonoamide e dei suoi derivati, ha dimostrato di inibire la crescita e la germinazione della popolare pianta modello Arabidopsis thaliana. In uno studio sulla relazione struttura-attività, abbiamo scoperto che un composto con C9 modificato in acido ursonico, chiamato derivato nonilossilico dell'acido ursonico (KAND), aumenta significativamente l'effetto inibitorio su crescita e germinazione. In particolare, il nuovo inibitore della crescita vegetale ha influenzato anche la crescita di tabacco ed epatiche e non si è dimostrato citotossico per batteri o cellule HeLa. Inoltre, alcuni derivati dell'acido urmotonico inducono un fenotipo radicale distorto, il che implica che questi derivati influenzino direttamente o indirettamente i microtubuli. Coerentemente con questa idea, le nostre osservazioni di microtubuli marcati immunoistochimicamente o con proteine fluorescenti indicano che il trattamento con KAND depolimerizza i microtubuli. Inoltre, il trattamento con derivati dell'acido kummotonico ha interrotto i microfilamenti di actina. Pertanto, abbiamo scoperto un nuovo inibitore della crescita vegetale il cui meccanismo d'azione unico prevede la distruzione del citoscheletro.
Il ceppo MK493-CF1 è stato isolato dal suolo di Shinagawa-ku, Tokyo. Il ceppo MK493-CF1 ha formato un micelio stromale ben ramificato. È stata determinata la sequenza parziale del gene dell'RNA ribosomiale 16S (1422 bp). Questo ceppo è molto simile a S. werraensis (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 bp, T: ceppo tipico, 99,93%). Sulla base di questo risultato, è stato determinato che questo ceppo era strettamente correlato al ceppo tipo di S. werraensis. Pertanto, abbiamo provvisoriamente denominato questo ceppo S. werraensis MK493-CF1. Anche S. werraensis ISP 5486T produce gli stessi composti bioattivi. Poiché inizialmente erano poche le ricerche sull'ottenimento di prodotti naturali da questo microrganismo, sono state condotte ulteriori ricerche chimiche. Dopo la coltivazione di S. werraensis MK493-CF1 su terreno d'orzo mediante fermentazione allo stato solido a 30 °C per 14 giorni, il terreno è stato estratto con EtOH al 50%. 60 ml di campione sono stati essiccati per ottenere 59,5 mg di estratto grezzo. L'estratto grezzo è stato sottoposto a HPLC in fase inversa per ottenere N-metossi-1H-pirrolo-2-carbossammide (1, denominata cumamonamide, 36,0 mg). La quantità totale di 1 rappresenta circa il 60% dell'estratto grezzo. Pertanto, abbiamo deciso di studiare in dettaglio le proprietà della kumamotoamide 1.
La cumamonamide 1 è una polvere amorfa bianca e la spettrometria di massa ad alta risoluzione (HRESIMS) conferma la presenza di C6H8N2O2 (Fig. 1). Il frammento pirrolico C2-sostituito di questo composto è caratterizzato da δH 6,94 (1H, t, J = 2,8, 4,8 Hz, H-4), δH 6,78 (1H, d, J = 2,5, δH nello spettro NMR 1H: 4,5 Hz, H-5) e δH 6,78 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-6), mentre lo spettro NMR 13C mostra la presenza di quattro atomi di carbonio sp2. La presenza di un gruppo ammidico in posizione C2 è stata valutata mediante correlazione HMBC dal protone C-3 al carbonio carbonilico dell'ammide a δC 161,1. Inoltre, i picchi NMR di 1H e 13C a δH 4,10 (3H, S) e δC 68,3 indicano la presenza di gruppi N-metossilici nella molecola. Sebbene la posizione corretta del gruppo metossilico non fosse ancora stata determinata utilizzando analisi spettroscopiche come la spettroscopia a differenza aumentata e la sigla di Overhauser nucleare (NOEDF), la N-metossi-1H-pirrolo-2-carbossammide è diventata il primo composto candidato.
Per determinare la struttura corretta di 1, è stata eseguita una sintesi totale (Fig. 2a). Il trattamento della 2-amminopiridina 2 disponibile in commercio con m-CPBA ha prodotto il corrispondente N-ossido 3 con resa quantitativa. Dopo la 2-amminoazidazione di 2, la reazione di ciclocondensazione descritta da Abramovich è stata condotta in benzene a 90 °C per ottenere l'1-idrossi-1H-pirrolo-2-carbonitrile 5 desiderato in grammi. Velocità 60% (due stadi). 15,16. La metilazione e l'idrolisi di 4 hanno quindi prodotto l'acido 1-metossi-1H-pirrolo-2-carbossilico (chiamato "acido cumotonico", 6) con buona resa (70%, due stadi). Infine, l'amidazione tramite l'intermedio cloruro acido 6 utilizzando ammoniaca acquosa ha prodotto l'ammide di Kumamoto 1 con resa del 98%. Tutti i dati spettrali dell'1 sintetizzato erano simili all'1 isolato, quindi è stata determinata la struttura dell'1;
Sintesi generale e analisi dell'attività biologica di urbenamide e acido urbenico. (a) Sintesi totale dell'ammide di Kumamoto. (b) Piantine di Arabidopsis Columbia (Col) di tipo selvatico di sette giorni sono state coltivate su piastre di Murashige e Skoog (MS) contenenti cumamonamide 6 o cumamonamide 1 alle concentrazioni indicate. Barra della scala = 1 cm.
In primo luogo, abbiamo valutato le attività biologiche dell'urbenamide e dei suoi intermedi per la loro capacità di modulare la crescita delle piante. Abbiamo aggiunto diverse concentrazioni di ursmonamide 1 o acido ursonico 6 al terreno di coltura MS agar e coltivato piantine di Arabidopsis thaliana su questo terreno. Questi test hanno mostrato che alte concentrazioni (500 μM) di 6 inibivano la crescita radicale (Fig. 2b). Successivamente, abbiamo generato diversi derivati sostituendo la posizione N1 di 6 e condotto studi sulla relazione struttura-attività su di essi (il processo di sintesi degli analoghi è descritto nelle Informazioni di Supporto (SI)). Le piantine di Arabidopsis sono state coltivate su un terreno di coltura contenente 50 μM di derivati dell'acido ursonico ed è stata misurata la lunghezza delle radici, come mostrato in figura. Come mostrato nelle Figure 3a, b e S1, gli acidi cumamici presentano diverse lunghezze di catene alcossiliche lineari (9, 10, 11, 12 e 13) o catene alcossiliche di grandi dimensioni (15, 16 e 17) in posizione N1. I derivati hanno mostrato una significativa inibizione della crescita radicale. Inoltre, abbiamo riscontrato che l'applicazione di 200 μM di 10, 11 o 17 ha inibito la germinazione (Figure 3c e S2).
Studio della relazione struttura-attività dell'ammide di Kumamoto e dei composti correlati. (a) Struttura e schema di sintesi degli analoghi. (b) Quantificazione della lunghezza delle radici di piantine di 7 giorni coltivate su terreno MS con o senza derivati cumamonammidici 50 μM. Gli asterischi indicano differenze significative con il trattamento fittizio (test t, p< 0,05).18. I dati sono mostrati come media ± DS. nt significa "non testato" perché oltre il 50% dei semi non è germinato. (c) Quantificazione del tasso di germinazione dei semi trattati e incubati per 7 giorni in terreno MS con o senza 200 μM di cumamonamide e composti correlati. Gli asterischi indicano differenze significative con il trattamento fittizio (test del chi-quadrato). n=96.
È interessante notare che l'aggiunta di catene laterali alchiliche più lunghe di C9 ha ridotto l'attività inibitoria, il che suggerisce che i composti correlati all'acido kumamotoico necessitano di catene laterali di una certa dimensione per manifestare la loro attività biologica.
Poiché l'analisi della relazione struttura-attività ha mostrato che C9 era stato modificato in acido ursonico e che il derivato nonilossilico dell'acido ursonico (di seguito denominato KAND 11) era l'inibitore più efficace della crescita delle piante, abbiamo condotto una caratterizzazione più dettagliata di KAND 11. Il trattamento di Arabidopsis con 50 μM di KAND 11 ha prevenuto quasi completamente la germinazione, mentre concentrazioni inferiori (40, 30, 20 o 10 μM) di KAND 11 hanno inibito la crescita radicale in modo dose-dipendente (Fig. 4a, b). Per verificare se KAND 11 influenzi la vitalità dei meristemi radicali, abbiamo esaminato i meristemi radicali colorati con ioduro di propidio (PI) e ne abbiamo misurato la dimensione dell'area. La dimensione del meristema delle piantine cresciute su un terreno contenente 25 μM di KAND-11 era di 151,1 ± 32,5 μm, mentre la dimensione del meristema delle piantine cresciute su un terreno di controllo contenente DMSO era di 264,7 ± 30,8 μm (Fig. 4c, d), il che indica che KAND-11 ripristina l'attività cellulare. diffusione. Meristema radicale. Coerentemente con ciò, il trattamento con KAND 11 ha ridotto la quantità di segnale del marcatore di divisione cellulare CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS nel meristema radicale (Fig. 4e) 17 . Questi risultati indicano che KAND 11 inibisce la crescita radicale riducendo l'attività di proliferazione cellulare.
Analisi dell'effetto inibitorio dei derivati dell'acido urbenonico (derivati dell'urbenilossi) sulla crescita. (a) Piantine di Col selvatico di 7 giorni coltivate su piastre MS con le concentrazioni indicate di KAND 11. Barra della scala = 1 cm. (b) Quantificazione della lunghezza delle radici. Le lettere indicano differenze significative (test Tukey HSD, p< 0,05).16. I dati sono mostrati come media ± DS. (c) Microscopia confocale di radici di Col selvatico colorate con ioduro di propidio, cresciute su piastre MS con o senza 25 μM di KAND 11. Le parentesi bianche indicano il meristema radicale. Barra della scala = 100 μm. (d) Quantificazione delle dimensioni del meristema radicale (n = 10-11). Le differenze statistiche sono state determinate utilizzando il t-test (p< 0,05). Le barre rappresentano la dimensione media del meristema. (e) Microscopia a contrasto di interferenza differenziale (DIC) di un meristema radicale contenente il costrutto CDKB2; 1pro: CDKB2; 1-GUS colorato e colorato su piantine di 5 giorni cresciute su piastre MS con o senza saggio KAND 25 µM.
La fitotossicità di KAND 11 è stata ulteriormente testata utilizzando un'altra pianta dicotiledone, il tabacco (Nicotiana tabacum), e un importante organismo modello di pianta terrestre, l'epatica (Marchantia polymorpha). Come nel caso di Arabidopsis, le piantine di tabacco SR-1 coltivate su un substrato contenente 25 μM di KAND 11 hanno prodotto radici più corte (Fig. 5a). Inoltre, 40 dei 48 semi sono germinati su piastre contenenti 200 μM di KAND 11, mentre tutti i 48 semi sono germinati su substrati trattati con un fittizio, indicando che concentrazioni più elevate di KAND erano significative (p< 0,05; test del chi quadrato) ha inibito la germinazione del tabacco (Fig. 5b). Inoltre, la concentrazione di KAND 11 che ha inibito la crescita batterica nell'epatica era simile alla concentrazione efficace in Arabidopsis (Fig. 5c). Questi risultati indicano che KAND 11 può inibire la crescita di una varietà di piante. Abbiamo poi studiato la possibile citotossicità di composti correlati alla monoammide dell'orso in altri organismi, in particolare cellule HeLa umane ed Escherichia coli ceppo DH5α, come rappresentanti rispettivamente di cellule animali superiori e batteriche. In una serie di test di proliferazione cellulare, abbiamo osservato che la cumamonamide 1, l'acido cumamonamidico 6 e KAND 11 non hanno influenzato la crescita di cellule HeLa o E. coli a concentrazioni di 100 μM (Fig. 5d,e).
Inibizione della crescita di KAND 11 in organismi non Arabidopsis. (a) Piantine di tabacco SR-1 selvatico di due settimane sono state coltivate su piastre MS posizionate verticalmente contenenti 25 μM di KAND 11. (b) Piantine di tabacco SR-1 selvatico di due settimane sono state coltivate su piastre MS posizionate orizzontalmente contenenti 200 μM di KAND 11. (c) Gemme di epatiche Tak-1 selvatico di due settimane coltivate su piastre Gamborg B5 con le concentrazioni indicate di KAND 11. Le frecce rosse indicano le spore che hanno smesso di crescere entro il periodo di incubazione di due settimane. (d) Saggio di proliferazione cellulare di cellule HeLa. Il numero di cellule vitali è stato misurato a intervalli di tempo fissi utilizzando un kit di conteggio cellulare 8 (Dojindo). Come controllo, le cellule HeLa sono state trattate con 5 μg/ml di actinomicina D (Act D), che inibisce la trascrizione dell'RNA polimerasi e causa la morte cellulare. Le analisi sono state eseguite in triplicato. (e) Saggio di proliferazione cellulare di E. coli. La crescita di E. coli è stata analizzata misurando OD600. Come controllo, le cellule sono state trattate con 50 μg/ml di ampicillina (Amp), che inibisce la sintesi della parete cellulare batterica. Le analisi sono state eseguite in triplicato.
Per decifrare il meccanismo d'azione della citotossicità causata da composti correlati all'uramide, abbiamo rianalizzato derivati dell'acido urbenico con effetti inibitori moderati, come mostrato nell'immagine. Come mostrato nelle Figure 2b, 6a, le piantine cresciute su piastre di agar contenenti alte concentrazioni (200 μM) di acido urmotonico 6 hanno prodotto radici più corte e ricurve verso sinistra (θ = – 23,7 ± 6,1), mentre le piantine cresciute sul terreno di controllo hanno prodotto radici quasi dritte (θ = – 3,8 ± 7,1). È noto che questa caratteristica crescita obliqua deriva da una disfunzione dei microtubuli corticali14,18. In linea con questo risultato, i farmaci destabilizzanti i microtubuli disopiramide e orizalina hanno indotto un'inclinazione radicale simile nelle nostre condizioni di crescita (Figure 2b, 6a). Allo stesso tempo, abbiamo testato derivati dell'acido urmotonico e ne abbiamo selezionati diversi che, a determinate concentrazioni, inducevano una crescita radicale obliqua. I composti 8, 9 e 15 hanno modificato la direzione della crescita radicale rispettivamente a 75 μM, 50 μM e 40 μM, indicando che questi composti possono destabilizzare efficacemente i microtubuli (Fig. 2b, 6a). Abbiamo anche testato il derivato dell'acido ursolico più potente, KAND 11, a una concentrazione inferiore (15 μM) e abbiamo scoperto che l'applicazione di KAND 11 ha inibito la crescita radicale e che la direzione di crescita delle radici era irregolare, sebbene tendessero a inclinarsi verso sinistra (Figura C3). Poiché concentrazioni più elevate di farmaci destabilizzanti i microtubuli a volte inibiscono la crescita delle piante anziché causare l'inclinazione delle radici, abbiamo successivamente valutato la possibilità che KAND 11 influisca sui microtubuli osservando i microtubuli corticali nelle cellule epidermiche delle radici. L'immunoistochimica, utilizzando anticorpi anti-β-tubulina in cellule epidermiche di radici di plantule trattate con 25 μM di KAND 11, ha mostrato la scomparsa di quasi tutti i microtubuli corticali nelle cellule epidermiche nella zona di allungamento (Fig. 6b). Questi risultati indicano che l'acido kumamotonico e i suoi derivati agiscono direttamente o indirettamente sui microtubuli, distruggendoli, e che questi composti rappresentano nuovi inibitori dei microtubuli.
L'acido ursonico e i suoi derivati alterano i microtubuli corticali in Arabidopsis thaliana. (a) Angolo di inclinazione delle radici misurato in presenza di vari derivati dell'acido ursonico alle concentrazioni indicate. Sono stati analizzati anche gli effetti di due composti noti per inibire i microtubuli: disopiramide e orizalina. Il riquadro mostra lo standard utilizzato per misurare l'angolo di crescita delle radici. Gli asterischi indicano differenze significative con il trattamento fittizio (test t, p< 0,05).19. Barra della scala = 1 cm. (b) Microtubuli corticali nelle cellule epidermiche nella zona di allungamento. I microtubuli nelle radici di Arabidopsis Col wild-type cresciute su piastre MS con o senza 25 μM di KAND 11 sono stati visualizzati mediante colorazione immunoistochimica utilizzando anticorpi primari anti-β-tubulina e anticorpi secondari coniugati con Alexa Fluor. Barra della scala = 10 µm. (c) Struttura mitotica dei microtubuli nel meristema radicale. I microtubuli sono stati visualizzati mediante colorazione immunoistochimica. Le strutture mitotiche, comprese le zone di profase, i fusi e i fragmoplasti, sono state contate da immagini confocali. Le frecce indicano le strutture dei microtubuli mitotici. Gli asterischi indicano differenze significative con il trattamento simulato (test t, p< 0,05).9. Barra della scala = 50 µm.
Sebbene Ursa abbia la capacità di interrompere la funzione dei microtubuli, si prevede che il suo meccanismo d'azione sia diverso da quello dei tipici agenti depolimerizzanti i microtubuli. Ad esempio, concentrazioni più elevate di agenti depolimerizzanti i microtubuli come disopiramide e orizalina inducono un'espansione anisotropica delle cellule epidermiche, mentre KAND 11 non lo fa. Inoltre, la co-applicazione di KAND 11 e disopiramide ha determinato una risposta combinata di crescita radicale indotta da disopiramide ed è stata osservata un'inibizione della crescita indotta da KAND 11 (Fig. S4). Abbiamo anche analizzato la risposta del mutante ipersensibile disopiramide 1-1 (phs1-1) a KAND 11. phs1-1 presenta una mutazione puntiforme non canonica della tubulina chinasi e produce radici più corte quando trattato con disopiramide9,20. Le piantine mutanti phs1-1 coltivate su terreno agarizzato contenente KAND 11 avevano radici più corte, simili a quelle coltivate su disopiramide (fig. S5).
Inoltre, abbiamo osservato strutture di microtubuli mitotici, come zone di profase, fusi e fragmoplasti, nel meristema radicale di piantine trattate con KAND 11. In linea con le osservazioni per CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS, è stata osservata una significativa diminuzione del numero di microtubuli mitotici (Fig. 6c).
Per caratterizzare la citotossicità di KAND 11 a risoluzione subcellulare, abbiamo trattato cellule di sospensione BY-2 di tabacco con KAND 11 e osservato la loro risposta. Abbiamo prima aggiunto KAND 11 a cellule BY-2 che esprimevano TagRFP-TUA6, che marca in modo fluorescente i microtubuli, per valutare l'effetto di KAND 11 sui microtubuli corticali. La densità dei microtubuli corticali è stata valutata utilizzando l'analisi delle immagini, che ha quantificato la percentuale di pixel del citoscheletro tra i pixel citoplasmatici. I risultati del test hanno mostrato che dopo il trattamento con 50 μM o 100 μM di KAND 11 per 1 ora, la densità è diminuita significativamente allo 0,94 ± 0,74% o allo 0,23 ± 0,28%, rispettivamente, mentre la densità delle cellule trattate con DMSO è stata pari all'1,61 ± 0,34% (Fig. 7a). Questi risultati sono coerenti con l'osservazione in Arabidopsis che il trattamento con KAND 11 induce la depolimerizzazione dei microtubuli corticali (Fig. 6b). Abbiamo anche esaminato la linea BY-2 con filamenti di actina marcati con GFP-ABD dopo trattamento con la stessa concentrazione di KAND 11 e abbiamo osservato che il trattamento con KAND 11 ha interrotto i filamenti di actina. Il trattamento con 50 μM o 100 μM di KAND 11 per 1 ora ha ridotto significativamente la densità dei filamenti di actina a 1,20 ± 0,62% o 0,61 ± 0,26%, rispettivamente, mentre la densità nelle cellule trattate con DMSO era 1,69 ± 0,51% (Fig. 2). 7b). Questi risultati contrastano con gli effetti della propizamide, che non influisce sui filamenti di actina, e della latrunculina B, un depolimerizzatore dell'actina che non influisce sui microtubuli (SI Figura S6). Inoltre, il trattamento con cumamonamide 1, acido cumamonamide 6 o KAND 11 non ha influenzato i microtubuli nelle cellule HeLa (Figura S7). Pertanto, si ritiene che il meccanismo d'azione di KAND 11 sia diverso da quello dei noti disruptori del citoscheletro. Inoltre, la nostra osservazione microscopica di cellule BY-2 trattate con KAND 11 ha rivelato l'inizio della morte cellulare durante il trattamento con KAND 11 e ha mostrato che la percentuale di cellule morte colorate con blu di Evans non è aumentata significativamente dopo 30 minuti di trattamento con KAND 11, mentre dopo 90 minuti di trattamento con 50 μM o 100 μM di KAND, il numero di cellule morte è aumentato rispettivamente al 43,7% o all'80,1% (Fig. 7c). Nel complesso, questi dati indicano che il nuovo derivato dell'acido ursolico KAND 11 è un inibitore del citoscheletro specifico delle piante con un meccanismo d'azione precedentemente sconosciuto.
KAND influenza i microtubuli corticali, i filamenti di actina e la vitalità delle cellule BY-2 di tabacco. (a) Visualizzazione dei microtubuli corticali nelle cellule BY-2 in presenza di TagRFP-TUA6. Le cellule BY-2 trattate con KAND 11 (50 μM o 100 μM) o DMSO sono state esaminate mediante microscopia confocale. La densità dei microtubuli corticali è stata calcolata da micrografie di 25 cellule indipendenti. Le lettere indicano differenze significative (test Tukey HSD, p< 0,05). Barra di scala = 10 µm. (b) Filamenti di actina corticale nelle cellule BY-2 visualizzati in presenza di GFP-ABD2. Le cellule BY-2 trattate con KAND 11 (50 µM o 100 µM) o DMSO sono state esaminate mediante microscopia confocale. La densità dei filamenti di actina corticale è stata calcolata da micrografie di 25 cellule indipendenti. Le lettere indicano differenze significative (test Tukey HSD, p< 0,05). Barra di scala = 10 µm. (c) Osservazione di cellule BY-2 morte mediante colorazione con blu di Evans. Le cellule BY-2 trattate con KAND 11 (50 µM o 100 µM) o DMSO sono state esaminate mediante microscopia a campo chiaro. n=3. Barra di scala = 100 µm.
La scoperta e l'applicazione di nuovi prodotti naturali hanno portato a progressi significativi in vari aspetti della vita umana, tra cui la medicina e l'agricoltura. Sono state condotte ricerche storiche per ottenere composti utili dalle risorse naturali. In particolare, gli attinomiceti sono noti per essere utili come antibiotici antiparassitari per i nematodi grazie alla loro capacità di produrre vari metaboliti secondari come l'avermectina, il composto principale dell'ivermectina, e la bleomicina e i suoi derivati, utilizzati in medicina come agenti antitumorali21,22. Analogamente, dagli attinomiceti sono stati scoperti diversi composti erbicidi, alcuni dei quali sono già utilizzati commercialmente1,23. Pertanto, l'analisi dei metaboliti degli attinomiceti per isolare prodotti naturali con attività biologiche desiderate è considerata una strategia efficace. In questo studio, abbiamo scoperto un nuovo composto, la cumamonamide, da S. werraensis e lo abbiamo sintetizzato con successo. L'acido ursonico è un intermedio sintetico dell'urbenamide e dei suoi derivati. Può causare il caratteristico arricciamento delle radici, mostrare un'attività erbicida da moderata a forte e danneggiare direttamente o indirettamente i microtubuli delle piante. Tuttavia, il meccanismo d'azione dell'acido urmotonico può differire da quello degli inibitori dei microtubuli esistenti, poiché KAND 11 interrompe anche i filamenti di actina e causa la morte cellulare, suggerendo un meccanismo regolatore attraverso il quale l'acido urmotonico e i suoi derivati influenzano un'ampia gamma di strutture citoscheletriche.
Un'ulteriore caratterizzazione dettagliata dell'acido urbenonico contribuirà a comprenderne meglio il meccanismo d'azione. In particolare, il prossimo obiettivo è valutare la capacità dell'acido ursonico di legarsi ai microtubuli ridotti per determinare se l'acido ursonico e i suoi derivati agiscano direttamente sui microtubuli depolimerizzandoli, oppure se la loro azione determini la destabilizzazione dei microtubuli. Inoltre, nel caso in cui i microtubuli non costituiscano un bersaglio diretto, l'identificazione del sito d'azione e dei bersagli molecolari dell'acido ursonico sulle cellule vegetali contribuirà a comprendere meglio le proprietà dei composti correlati e i possibili modi per migliorare l'attività erbicida. Il nostro test di bioattività ha rivelato l'esclusiva capacità citotossica dell'acido ursonico sulla crescita di piante come Arabidopsis thaliana, tabacco ed epatiche, senza che Escherichia coli né cellule HeLa siano state interessate. La scarsa o nulla tossicità per le cellule animali rappresenta un vantaggio dei derivati dell'acido ursonico se sviluppati come erbicidi per l'uso in campi agricoli aperti. Infatti, poiché i microtubuli sono strutture comuni negli eucarioti, la loro inibizione selettiva nelle piante è un requisito fondamentale per gli erbicidi. Ad esempio, la propizamide, un agente depolimerizzante dei microtubuli che si lega direttamente alla tubulina e inibisce la polimerizzazione, viene utilizzata come erbicida per la sua bassa tossicità per le cellule animali24. A differenza della disopiramide, le benzamidi correlate presentano diverse specificità di bersaglio. Oltre ai microtubuli delle piante, l'RH-4032 o la benzoxamide inibiscono anche i microtubuli delle cellule animali o degli oomiceti, rispettivamente, e la zalilamide viene utilizzata come fungicida per la sua bassa fitotossicità25,26,27. L'orso recentemente scoperto e i suoi derivati mostrano citotossicità selettiva contro le piante, ma è opportuno notare che ulteriori modifiche potrebbero alterarne la specificità di bersaglio, fornendo potenzialmente derivati aggiuntivi per il controllo di funghi patogeni o oomiceti.
Le proprietà uniche dell'acido urbenonico e dei suoi derivati sono utili per il loro sviluppo come erbicidi e per l'utilizzo come strumenti di ricerca. L'importanza del citoscheletro nel controllo della forma delle cellule vegetali è ampiamente riconosciuta. Studi precedenti hanno dimostrato che le piante hanno sviluppato complessi meccanismi di organizzazione dei microtubuli corticali controllandone la dinamica per controllare adeguatamente la morfogenesi. È stato identificato un gran numero di molecole responsabili della regolazione dell'attività dei microtubuli e la ricerca correlata è ancora in corso3,4,28. La nostra attuale comprensione della dinamica dei microtubuli nelle cellule vegetali non spiega completamente i meccanismi di organizzazione dei microtubuli corticali. Ad esempio, sebbene sia la disopiramide che l'orizalina possano depolimerizzare i microtubuli, la disopiramide causa una grave distorsione radicale mentre l'orizalina ha un effetto relativamente lieve. Inoltre, le mutazioni della tubulina, che stabilizza i microtubuli, causano anche destrorotazione nelle radici, mentre il paclitaxel, che stabilizza anch'esso la dinamica dei microtubuli, non lo fa. Pertanto, lo studio e l'identificazione dei bersagli molecolari dell'acido ursolico dovrebbero fornire nuove informazioni sulla regolazione dei microtubuli corticali delle piante. Allo stesso modo, futuri confronti tra sostanze chimiche efficaci nel promuovere la crescita distorta, come la disopiramide, e sostanze meno efficaci, come l'orizalina o l'acido kumamotorio, forniranno indizi su come si verifica la crescita distorta.
D'altra parte, i riarrangiamenti citoscheletrici correlati alla difesa rappresentano un'altra possibilità per spiegare la citotossicità dell'acido ursonico. L'infezione di un agente patogeno o l'introduzione di un elicitore nelle cellule vegetali a volte causa la distruzione del citoscheletro e la successiva morte cellulare29. Ad esempio, è stato riportato che la criptoxantina derivata da oomiceti distrugge i microtubuli e i filamenti di actina prima della morte delle cellule del tabacco, in modo simile a quanto accade con il trattamento con KAND30,31. Le somiglianze tra le risposte di difesa e le risposte cellulari indotte dall'acido ursonico ci hanno portato a ipotizzare che inneschino processi cellulari comuni, sebbene sia evidente un effetto più rapido e più forte dell'acido ursonico rispetto alla criptoxantina. Tuttavia, studi hanno dimostrato che la rottura dei filamenti di actina promuove la morte cellulare spontanea, che non è sempre accompagnata dalla rottura dei microtubuli29. Inoltre, resta da vedere se il patogeno o l'elicitore causino una crescita distorta delle radici, come accade con i derivati dell'acido ursonico. Pertanto, la conoscenza molecolare che collega le risposte di difesa al citoscheletro rappresenta un problema interessante da affrontare. Sfruttando la presenza di composti a basso peso molecolare correlati all'acido ursonico, nonché di una gamma di derivati con diverse potenze, si potrebbero offrire opportunità per colpire meccanismi cellulari sconosciuti.
Nel complesso, la scoperta e l'applicazione di nuovi composti che modulano la dinamica dei microtubuli forniranno potenti metodi per affrontare i complessi meccanismi molecolari alla base della determinazione della forma delle cellule vegetali. In questo contesto, il composto acido urmotonico, recentemente sviluppato, che agisce sui microtubuli e sui filamenti di actina e induce la morte cellulare, potrebbe offrire un'opportunità per decifrare la connessione tra il controllo dei microtubuli e questi altri meccanismi. Pertanto, l'analisi chimica e biologica con l'acido urbenonico ci aiuterà a comprendere i meccanismi di regolazione molecolare che controllano il citoscheletro vegetale.
Inoculare S. werraensis MK493-CF1 in una beuta Erlenmeyer da 500 mL con filtro a matraccio contenente 110 mL di terreno di coltura composto da galattosio al 2% (p/v), pasta di essenza al 2% (p/v), composizione di Bacto all'1% (p/v), estratto di mais allo 0,5% (p/v) (KOGOSTCH Co., Ltd., Giappone), (NH4)2SO4 allo 0,2% (p/v) e CaCO3 allo 0,2% in acqua deionizzata. (pH 7,4 prima della sterilizzazione). Le colture di semi sono state incubate su un agitatore rotante (180 rpm) a 27 °C per 2 giorni. La coltivazione per la produzione è stata effettuata tramite fermentazione allo stato solido. La coltura dei semi (7 ml) è stata trasferita in un pallone K-1 da 500 ml contenente 40 g di terreno di coltura composto da 15 g di orzo pressato (MUSO Co., Ltd., Giappone) e 25 g di acqua deionizzata (pH non regolato prima della sterilizzazione). La fermentazione è stata condotta a 30 °C al buio per 14 giorni. Il materiale di fermentazione è stato estratto con 40 ml/flacone di EtOH e centrifugato (1500 g, 4 °C, 10 min). Il surnatante della coltura (60 ml) è stato estratto con una miscela al 10% di MeOH/EtOAc. Lo strato organico è stato evaporato a pressione ridotta per ottenere un residuo (59,5 mg), che è stato sottoposto a HPLC con eluizione a gradiente (0–10 minuti: 90%) su una colonna a fase inversa (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 μm, ID 10 mm × lunghezza 250 mm) H2O/CH3CN, 10–35 minuti: 90% H2O/CH3CN al 70% H2O/CH3CN (gradiente), 35–45 minuti: 90% H2O/EtOH, 45–155 minuti: 90% H2O/EtOH al 100% EtOH (gradiente (gradiente), 155–200 min: 100% EtOH) a una portata di 1,5 ml/min, la cumamonamide (1, 36,0 mg) è stata isolata come una polvere amorfa bianca.
Kumamotoamide(1); 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6,93 (t, J = 2,5 Hz, 1H), 6,76 (dd, J = 4,3, 1,8 Hz 1H), 6,05 (t , J = 3,8 Hz, 1H). ), 4,08 (s, 3H); 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) δ 161,1, 121,0, 119,9, 112,2, 105,0, 68,3; ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ valore calcolato: 141,0659, valore misurato: 141,0663, IR νmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 1537 cm–1.
I semi di Columbia (Col-0) sono stati ottenuti dall'Arabidopsis Biological Resource Center (ABRC) con autorizzazione per uso di ricerca. I semi di Col-0 sono stati propagati e mantenuti nelle nostre condizioni di laboratorio e utilizzati come piante di Arabidopsis selvatiche. I semi di Arabidopsis sono stati sterilizzati in superficie e coltivati in terreno di coltura Murashige e Skoog a metà concentrazione contenente il 2% di saccarosio (Fujifilm Wako Pure Chemical), lo 0,05% (p/v) di acido 2-(4-morfolino)etansolfonico (MES) (Fujifilm Wako Pure Chemical). e l'1,5% di agar (Fujifilm Wako Pure Chemical), pH 5,7, a 23 °C e luce costante. I semi del mutante phs1-1 sono stati forniti da T. Hashimoto (Nara Institute of Science and Technology).
I semi del ceppo SR-1 sono stati forniti da T. Hashimoto (Nara Institute of Science and Technology) e utilizzati come piante di tabacco selvatico. I semi di tabacco sono stati sterilizzati in superficie e immersi in acqua sterile per tre notti per favorirne la germinazione, quindi immersi in una soluzione a metà concentrazione contenente il 2% di saccarosio, lo 0,05% (p/v) di MES e lo 0,8% di gomma di gellano (Fujifilm Wako Pure Chemical) Murashige e Skoog medium) a pH 5,7 e incubati a 23 °C in condizioni di luce costante.
Il ceppo Tak-1 è stato fornito da T. Kohchi (Università di Kyoto) ed è stato utilizzato come unità sperimentale standard per lo studio sulle epatiche. Gemma è stata ottenuta da piante sterilizzate in coltura e poi seminata su terreno di coltura Gamborg B5 (Fujifilm Wako Pure Chemical) contenente l'1% di saccarosio e lo 0,3% di gomma di gellano e incubata a 23 °C in luce continua.
Le cellule BY-2 di tabacco (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2) sono state fornite da S. Hasezawa (Università di Tokyo). Le cellule BY-2 sono state diluite 95 volte in terreno di coltura Linsmeier e Skoog modificato e supplementate settimanalmente con acido 2,4-diclorofenossiacetico 32 . La sospensione cellulare è stata miscelata su un agitatore rotante a 130 rpm a 27 °C al buio. Lavare le cellule con 10 volte il volume di terreno di coltura fresco e risospendere nello stesso terreno. Linee cellulari transgeniche BY-2 che esprimono stabilmente il marcatore dei microtubuli TagRFP-TUA6 o il marcatore dei filamenti di actina GFP-ABD2 sotto il promotore 35S del virus del mosaico del cavolfiore sono state generate come descritto 33, 34, 35. Queste linee cellulari possono essere mantenute e sincronizzate utilizzando procedure simili a quelle utilizzate per la linea cellulare BY-2 originale.
Le cellule HeLa sono state coltivate in terreno di coltura DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) (Life Technologies) arricchito con siero bovino fetale al 10%, 1,2 U/ml di penicillina e 1,2 μg/ml di streptomicina in un'incubatrice a 37°C con il 5% di CO2.
Tutti gli esperimenti descritti nel presente manoscritto sono stati eseguiti in conformità con le normative e le linee guida giapponesi sulla biosicurezza.
I composti sono stati sciolti in dimetilsolfossido (DMSO; Fujifilm Wako Pure Chemical) come soluzioni madre e diluiti in terreno MS per Arabidopsis e tabacco o terreno Gamborg B5 per epatiche. Per il test di inibizione della crescita radicale, più di 10 semi per piastra sono stati seminati su terreno agarizzato contenente i composti indicati o DMSO. I semi sono stati incubati in una camera di crescita per 7 giorni. Le piantine sono state fotografate e la lunghezza delle radici è stata misurata. Per il test di germinazione di Arabidopsis, 48 semi per piastra sono stati seminati su terreno agarizzato contenente 200 μM di composto o DMSO. I semi di Arabidopsis sono stati coltivati in una camera di crescita e il numero di piantine germinate è stato contato 7 giorni dopo la germinazione (dag). Per il test di germinazione di tabacco, 24 semi per piastra sono stati seminati su terreno agarizzato contenente 200 μM di KAND o DMSO. I semi di tabacco sono stati coltivati in una camera di crescita e il numero di piantine germinate è stato contato dopo 14 giorni. Per il test di inibizione della crescita dell'epatica, 9 embrioni di ciascuna piastra sono stati seminati su terreno agarizzato contenente le concentrazioni indicate di KAND o DMSO e incubati in una camera di crescita per 14 giorni.
Utilizzare piantine colorate con ioduro di propidio (PI) 5 mg/ml per visualizzare l'organizzazione del meristema radicale. I segnali di PI sono stati osservati mediante microscopia a fluorescenza utilizzando un microscopio confocale a scansione laser TCS SPE (Leica Microsystems).
La colorazione istochimica delle radici con β-glucuronidasi (GUS) è stata eseguita secondo il protocollo descritto da Malami e Benfey36. Le piantine sono state fissate in acetone al 90% per una notte, colorate con 0,5 mg/ml di acido 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-d-glucuronico in tampone GUS per 1 ora e immerse in una soluzione di cloraldeide idrata (8 g di cloralio idrato, 2 ml di acqua e 1 ml di glicerolo) e osservate mediante microscopia a contrasto interferenziale differenziale utilizzando un microscopio Axio Imager M1 (Carl Zeiss).
Gli angoli delle radici sono stati misurati su piantine di 7 giorni coltivate su piastre posizionate verticalmente. Misurare l'angolo della radice rispetto alla direzione del vettore di gravità, come descritto al punto 6.
La disposizione dei microtubuli corticali è stata osservata come descritto, con piccole modifiche al protocollo 37 . L'anticorpo anti-β-tubulina (KMX-1, Merk Millipore: MAB3408) e l'anticorpo anti-IgG murino coniugato con Alexa Fluor 488 (Thermo Fisher Scientific: A32723) sono stati utilizzati come anticorpi primari e secondari rispettivamente a diluizioni 1:1000 e 1:100. Le immagini di fluorescenza sono state acquisite utilizzando un microscopio confocale a scansione laser TCS SPE (Leica Microsystems). Acquisire immagini Z-stack e creare proiezioni di massima intensità secondo le istruzioni del produttore.
Il test di proliferazione delle cellule HeLa è stato eseguito utilizzando il Cell Counting Kit 8 (Dojindo) secondo le istruzioni del produttore.
La crescita di E. coli DH5α è stata analizzata misurando la densità cellulare in coltura utilizzando uno spettrofotometro a 600 nm (OD600).
L'organizzazione del citoscheletro nelle cellule transgeniche BY-2 è stata osservata utilizzando un microscopio a fluorescenza dotato di un dispositivo di scansione confocale CSU-X1 (Yokogawa) e di una fotocamera sCMOS (Zyla, Andor Technology). La densità del citoscheletro è stata valutata mediante analisi delle immagini, che ha quantificato la percentuale di pixel citoscheletrici tra i pixel citoplasmatici nelle immagini confocali utilizzando il software ImageJ, come descritto38,39.
Per rilevare la morte cellulare nelle cellule BY-2, un'aliquota della sospensione cellulare è stata incubata con blu di Evans allo 0,05% per 10 minuti a temperatura ambiente. La colorazione selettiva con blu di Evans delle cellule morte dipende dall'estrusione del colorante dalle cellule vitali da parte della membrana plasmatica intatta40. Le cellule colorate sono state osservate utilizzando un microscopio a campo chiaro (BX53, Olympus).
Le cellule HeLa sono state coltivate in DMEM supplementato con il 10% di FBS in un incubatore umidificato a 37 °C e 5% di CO2. Le cellule sono state trattate con 100 μM di KAND 11, acido kumamonamico 6, kumamonamide 1, 100 ng/ml di colcemid (Gibco) o 100 ng/ml di Nocodmaze (Sigma) per 6 ore a 37 °C. Le cellule sono state fissate con MetOH per 10 minuti e poi con acetato per 5 minuti a temperatura ambiente. Le cellule fissate sono state incubate con l'anticorpo primario anti-β-tubulina (1D4A4, Proteintech: 66240-1) diluito in BSA/PBS allo 0,5% per 2 ore, lavate 3 volte con TBST e quindi incubate con l'anticorpo di capra Alexa Fluor. 488 1 ora. – IgG di topo (Thermo Fisher Scientific: A11001) e 15 ng/ml di 4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) diluito in BSA/PBS allo 0,5%. Dopo tre lavaggi con TBST, le cellule colorate sono state osservate al microscopio invertito Nikon Eclipse Ti-E. Le immagini sono state acquisite con una telecamera CCD Hamamatsu ORCA-R2 raffreddata utilizzando il software MetaMorph (Molecular Devices).
Data di pubblicazione: 17-06-2024