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La scoperta e l’uso benefico dei prodotti naturali possono aiutare a migliorare la vita umana.Le sostanze chimiche che inibiscono la crescita delle piante sono ampiamente utilizzate come erbicidi per controllare le erbe infestanti.A causa della necessità di utilizzare diversi tipi di erbicidi, è necessario identificare composti con nuovi meccanismi d'azione.In questo studio, abbiamo scoperto un nuovo composto N-alcossipirrolico, la cumamonamide, dello Streptomyces werraensis MK493-CF1 e stabilito il processo di sintesi completo.Attraverso test di attività biologica, abbiamo scoperto che l'acido urs-monoammico è un intermedio sintetico dell'urs-monoammide e un potenzialeinibitore della crescita delle piante.Inoltre, abbiamo sviluppato vari derivati dell'acido urbenonico, incluso il derivato urbenilossi (UDA), che ha un'elevata attività erbicida senza influenzare negativamente la crescita delle cellule HeLa.Abbiamo anche scoperto che i derivati dell'acido urmotonico interrompono i microtubuli vegetali;inoltre, KAND colpisce i filamenti di actina e induce la morte cellulare;Questi effetti sfaccettati differiscono da quelli dei noti inibitori dei microtubuli e suggeriscono un nuovo meccanismo d’azione per l’acido ursonico, che rappresenta un importante vantaggio nello sviluppo di nuovi erbicidi.
La scoperta e l'applicazione pratica di prodotti naturali benefici e dei loro derivati è un mezzo per migliorare la qualità della vita umana.I metaboliti secondari prodotti da microrganismi, piante e insetti hanno portato a importanti progressi nella medicina e nell'agricoltura.Molti antibiotici e farmaci antileucemici sono stati sviluppati da prodotti naturali.Inoltre, vari tipi dipesticidiDa questi prodotti naturali si estraggono fungicidi ed erbicidi da utilizzare in agricoltura.In particolare, gli erbicidi per il controllo delle infestanti sono strumenti importanti per aumentare i raccolti nell’agricoltura moderna e vari tipi di composti sono già utilizzati in commercio.Diversi processi cellulari nelle piante, come la fotosintesi, il metabolismo degli aminoacidi, la sintesi della parete cellulare, la regolazione della mitosi, la segnalazione dei fitormoni o la sintesi proteica, sono considerati bersagli tipici degli erbicidi.I composti che inibiscono la funzione dei microtubuli sono una classe comune di erbicidi che influenzano la crescita delle piante influenzando la regolazione mitotica2.
I microtubuli sono componenti del citoscheletro e sono ampiamente conservati nelle cellule eucariotiche.L'eterodimero di tubulina è costituito da α-tubulina e β-tubulina che formano protofilamenti lineari di microtubuli, con 13 protofilamenti che formano una struttura cilindrica.I microtubuli svolgono molteplici ruoli nelle cellule vegetali, tra cui la determinazione della forma cellulare, la divisione cellulare e il trasporto intracellulare3,4.Le cellule vegetali contengono microtubuli sotto la membrana plasmatica interfase e si ritiene che questi cosiddetti microtubuli corticali controllino l'organizzazione delle microfibrille di cellulosa attraverso la regolazione dei complessi di cellulosa sintasi4,5.I microtubuli corticali delle cellule epidermiche della radice, presenti nella zona di rapido allungamento dell'apice della radice, si trovano lateralmente e le microfibre di cellulosa seguono questi microtubuli e limitano la direzione dell'espansione cellulare, promuovendo così l'allungamento anisotropo delle cellule.Pertanto, la funzione dei microtubuli è strettamente correlata alla morfologia della pianta.Le sostituzioni di aminoacidi nei geni che codificano per la tubulina causano distorsioni nella disposizione dei microtubuli corticali e crescita sul lato sinistro o destro nell'Arabidopsis 6,7.Allo stesso modo, anche le mutazioni nelle proteine associate ai microtubuli che regolano la dinamica dei microtubuli possono portare a una crescita distorta delle radici8,9,10,11,12,13.Inoltre, il trattamento con erbicidi che distruggono i microtubuli come la disopiramide, nota anche come pretilaclor, provoca anche la crescita delle radici oblique sul lato sinistro14.Questi dati indicano che la regolazione precisa della funzione dei microtubuli è fondamentale per determinare la direzione della crescita delle piante.
Sono stati scoperti vari tipi di inibitori dei microtubuli e questi farmaci hanno dato un contributo significativo alla ricerca sul citoscheletro, nonché all'agricoltura e alla medicina2.In particolare, l'orizalina, i composti dinitroanilina, la disopiramide, i composti correlati alla benzamide e i loro analoghi possono inibire la funzione dei microtubuli e quindi inibire la crescita delle piante.Pertanto, sono ampiamente utilizzati come erbicidi.Tuttavia, poiché i microtubuli sono una componente importante delle cellule vegetali e animali, la maggior parte degli inibitori dei microtubuli sono citotossici per entrambi i tipi di cellule.Pertanto, nonostante la loro riconosciuta utilità come erbicidi, un numero limitato di agenti antimicrotubuli viene utilizzato per scopi pratici.
Streptomyces è un genere della famiglia Streptomyces, che comprende batteri aerobici, gram-positivi e filamentosi ed è ampiamente noto per la sua capacità di produrre un'ampia gamma di metaboliti secondari.Pertanto, è considerata una delle fonti più importanti di nuovi prodotti naturali biologicamente attivi.Nel presente studio, abbiamo scoperto un nuovo composto chiamato cumamonamide, che è stato isolato da Streptomyces werraensis MK493-CF1 e S. werraensis ISP 5486. Utilizzando l'analisi spettrale e l'analisi spettrale completa, è stata caratterizzata la struttura della cumamonamide e il suo esclusivo scheletro N-alcossipirrolico era determinato.sintesi.Si è scoperto che l'acido ursmonico, un intermedio sintetico dell'ursmonoamide e dei suoi derivati, inibisce la crescita e la germinazione della popolare pianta modello Arabidopsis thaliana.In uno studio sulla relazione struttura-attività, abbiamo scoperto che un composto con C9 modificato in acido ursonico, chiamato derivato nonilossi dell'acido ursonico (KAND), migliora significativamente l'effetto inibitorio sulla crescita e sulla germinazione.In particolare, l’inibitore della crescita delle piante recentemente scoperto ha influenzato anche la crescita del tabacco e dell’erba epatica e non era citotossico per i batteri o le cellule HeLa.Inoltre, alcuni derivati dell’acido urmotonico inducono un fenotipo radicale distorto, il che implica che questi derivati influenzano direttamente o indirettamente i microtubuli.Coerentemente con questa idea, le nostre osservazioni di microtubuli marcati immunoistochimicamente o con proteine fluorescenti indicano che il trattamento KAND depolimerizza i microtubuli.Inoltre, il trattamento con derivati dell’acido kumamotonico ha interrotto i microfilamenti di actina.Pertanto, abbiamo scoperto un nuovo inibitore della crescita delle piante il cui meccanismo d'azione unico comporta la distruzione del citoscheletro.
Il ceppo MK493-CF1 è stato isolato dal suolo a Shinagawa-ku, Tokyo.Il ceppo MK493-CF1 ha formato un micelio stromale ben ramificato.È stata determinata la sequenza parziale del gene dell'RNA ribosomiale 16S (1422 bp).Questo ceppo è molto simile a S. werraensis (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 bp, T: ceppo tipico, 99,93%).Sulla base di questo risultato, è stato determinato che questo ceppo era strettamente correlato al ceppo tipo di S. werraensis.Pertanto, abbiamo provvisoriamente chiamato questo ceppo S. werraensis MK493-CF1.Anche S. werraensis ISP 5486T produce gli stessi composti bioattivi.Poiché le ricerche iniziali per ottenere prodotti naturali da questo microrganismo erano scarse, sono state condotte ulteriori ricerche chimiche.Dopo la coltivazione di S. werraensis MK493-CF1 su terreno d'orzo mediante fermentazione allo stato solido a 30°C per 14 giorni, il terreno è stato estratto con EtOH al 50%.60 ml di campione sono stati essiccati per ottenere 59,5 mg di estratto grezzo.L'estratto grezzo è stato sottoposto a HPLC in fase inversa per dare N-metossi-1H-pirrolo-2-carbossammide (1, denominata cumamonamide, 36,0 mg).La quantità totale di 1 rappresenta circa il 60% dell'estratto grezzo.Pertanto, abbiamo deciso di studiare in dettaglio le proprietà della kumamotoamide 1.
La cumamonamide 1 è una polvere amorfa bianca e la spettrometria di massa ad alta risoluzione (HRESIMS) conferma C6H8N2O2 (Fig. 1).Il frammento pirrolico C2-sostituito di questo composto è caratterizzato da δH 6,94 (1H, t, J = 2,8, 4,8 Hz, H-4), δH 6,78 (1H, d, J = 2,5, δH nello spettro NMR 1H: 4,5 Hz , H-5) e δH 6,78 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-6) e lo spettro NMR 13C mostra la presenza di quattro atomi di carbonio sp2.La presenza di un gruppo ammidico nella posizione C2 è stata valutata mediante correlazione HMBC dal protone C-3 al carbonio carbonilico ammidico a δC 161,1.Inoltre, i picchi NMR 1 H e 13 C a δH 4,10 (3H, S) e δC 68,3 indicano la presenza di gruppi N-metossi nella molecola.Sebbene la posizione corretta del gruppo metossi non fosse ancora stata determinata utilizzando l'analisi spettroscopica come la spettroscopia differenziale avanzata e l'abbreviazione nucleare Overhauser (NOEDF), N-metossi-1H-pirrolo-2-carbossammide è diventato il primo composto candidato.
Per determinare la struttura corretta di 1, è stata eseguita una sintesi totale (Fig. 2a).Il trattamento della 2-amminopiridina 2 disponibile in commercio con m-CPBA ha prodotto il corrispondente N-ossido 3 in resa quantitativa.Dopo la 2-amminoazidazione di 2, la reazione di ciclocondensazione descritta da Abramovich è stata condotta in benzene a 90°C per ottenere l'1-idrossi-1H-pirrolo-2-carbonitrile desiderato 5 in grammi.Velocità 60% (due fasi).15,16.La metilazione e l'idrolisi di 4 hanno poi dato acido 1-metossi-1H-pirrolo-2-carbossilico (chiamato "acido cumotonico", 6) con buona resa (70%, due passaggi).Infine, l'ammidazione tramite il cloruro acido intermedio 6 utilizzando ammoniaca acquosa ha dato l'ammide 1 di Kumamoto con una resa del 98%.Tutti i dati spettrali dell'1 sintetizzato erano simili all'1 isolato, quindi è stata determinata la struttura di 1;
Sintesi generale e analisi dell'attività biologica dell'urbenamide e dell'acido urbenico.(a) Sintesi totale dell'ammide di Kumamoto.(b) Piantine di Arabidopsis Columbia (Col) di tipo selvatico di sette giorni sono state coltivate su piastre Murashige e Skoog (MS) contenenti coumamonamide 6 o coumamonamide 1 alle concentrazioni indicate.Barra della scala = 1 cm.
Innanzitutto, abbiamo valutato le attività biologiche dell'urbenamide e dei suoi intermedi per la loro capacità di modulare la crescita delle piante.Abbiamo aggiunto varie concentrazioni di ursmonamide 1 o acido ursmonico 6 al terreno di agar MS e abbiamo coltivato piantine di Arabidopsis thaliana su questo terreno.Questi test hanno mostrato che alte concentrazioni (500 μM) di 6 inibiscono la crescita delle radici (Fig. 2b).Successivamente, abbiamo generato vari derivati sostituendo la posizione N1 di 6 e abbiamo eseguito studi sulle relazioni struttura-attività su di essi (il processo di sintesi analogica è descritto nelle Informazioni di supporto (SI)).Le piantine di Arabidopsis sono state coltivate su un terreno contenente 50 μM di derivati dell'acido ursonico ed è stata misurata la lunghezza della radice.come mostrato nell'immagine.Come mostrato nelle Figure 3a, b e S1, i cumamoacidi hanno diverse lunghezze di catene alcossiliche lineari (9, 10, 11, 12 e 13) o grandi catene alcossiliche (15, 16 e 17) nella posizione N1.I derivati hanno mostrato una significativa inibizione della crescita delle radici.Inoltre, abbiamo scoperto che l'applicazione di 200 μM 10, 11 o 17 ha inibito la germinazione (Fig. 3c e S2).
Studio della relazione struttura-attività dell'ammide di Kumamoto e composti correlati.(a) Struttura e schema di sintesi degli analoghi.(b) Quantificazione della lunghezza della radice di piantine di 7 giorni coltivate su terreno MS con o senza derivati della cumamonamide da 50 μM.Gli asterischi indicano differenze significative con il trattamento fittizio (t test, p<0,05).n>18. I dati sono mostrati come media ± DS.nt significa “non testato” perché più del 50% dei semi non è germinato.(c) Quantificazione del tasso di germinazione dei semi trattati incubati per 7 giorni in terreno MS con o senza cumamonamide da 200 μM e composti correlati.Gli asterischi indicano differenze significative con il trattamento fittizio (test del chi quadrato).n=96.
È interessante notare che l'aggiunta di catene laterali alchiliche più lunghe di C9 ha ridotto l'attività inibitoria, suggerendo che i composti correlati all'acido kumamotoico richiedono catene laterali di una certa dimensione per esibire la loro attività biologica.
Poiché l'analisi della relazione struttura-attività ha mostrato che C9 è stato modificato in acido ursonico e che il derivato nonilossi dell'acido ursonico (di seguito denominato KAND 11) era l'inibitore della crescita delle piante più efficace, abbiamo condotto una caratterizzazione più dettagliata di KAND 11. con 50 μM KAND 11 ha impedito quasi completamente la germinazione, mentre concentrazioni più basse (40, 30, 20 o 10 μM) di KAND 11 hanno inibito la crescita delle radici in modo dose-dipendente (Fig. 4a, b).Per verificare se KAND 11 influisce sulla vitalità del meristema della radice, abbiamo esaminato i meristemi della radice colorati con ioduro di propidio (PI) e misurato la dimensione dell'area del meristema.La dimensione del meristema delle piantine coltivate su un mezzo contenente 25 μM KAND-11 era 151,1 ± 32,5 μm, mentre la dimensione del meristema delle piantine coltivate su un mezzo di controllo contenente DMSO era 264,7 ± 30,8 μm (Fig. 4c, d) , il che indica che KAND-11 ripristina l'attività cellulare.diffondersi.Meristema della radice.Coerentemente con ciò, il trattamento con KAND 11 ha ridotto la quantità del marcatore di divisione cellulare CDKB2;1p::CDKB2;segnale 1-GUS nel meristema della radice (Fig. 4e) 17 .Questi risultati indicano che KAND 11 inibisce la crescita delle radici riducendo l'attività di proliferazione cellulare.
Analisi dell'effetto inibitorio dei derivati dell'acido urbenonico (derivati urbenilossi) sulla crescita.(a) Piantine di Col di tipo selvatico di 7 giorni coltivate su piastre MS con le concentrazioni indicate di KAND 11. Barra della scala = 1 cm.(b) Quantificazione della lunghezza della radice.Le lettere indicano differenze significative (test Tukey HSD, p<0,05).n>16. I dati sono mostrati come media ± DS.( c ) Microscopia confocale delle radici Col di tipo selvatico colorate con ioduro di propidio coltivate su piastre MS con o senza KAND 11 da 25 μM. Le parentesi bianche indicano il meristema della radice.Barra della scala = 100 µm.(d) Quantificazione della dimensione del meristema della radice (n = da 10 a 11).Le differenze statistiche sono state determinate utilizzando il t-test (p<0,05).Le barre rappresentano la dimensione media del meristema.(e) Microscopia a contrasto di interferenza differenziale (DIC) di un meristema della radice contenente il costrutto CDKB2;1pro: CDKB2;Colorato con 1-GUS e colorato su piantine di 5 giorni coltivate su piastre MS con o senza saggio KAND da 25 µM.
La fitotossicità di KAND 11 è stata ulteriormente testata utilizzando un'altra pianta dicotiledone, il tabacco (Nicotiana tabacum), e un importante organismo modello di pianta terrestre, l'erba epatica (Marchantia polymorpha).Come nel caso dell'Arabidopsis, le piantine di tabacco SR-1 coltivate su terreno contenente 25 μM KAND 11 hanno prodotto radici più corte (Fig. 5a).Inoltre, 40 semi su 48 germinarono su piastre contenenti 200 μM di KAND 11, mentre tutti i 48 semi germinarono su terreni finti trattati, indicando che concentrazioni più elevate di KAND erano significative (p<0,05;chi test -square) ha inibito la germinazione del tabacco.(Fig. 5b).Inoltre, la concentrazione di KAND 11 che inibiva la crescita batterica nell'erba epatica era simile alla concentrazione efficace nell'Arabidopsis (Fig. 5c).Questi risultati indicano che KAND 11 può inibire la crescita di una varietà di piante.Abbiamo quindi studiato la possibile citotossicità dei composti correlati alla monoammide dell'orso in altri organismi, vale a dire le cellule HeLa umane e il ceppo di Escherichia coli DH5α, come rappresentanti rispettivamente di cellule animali e batteriche superiori.In una serie di test di proliferazione cellulare, abbiamo osservato che la cumamonamide 1, l'acido coumamonamidico 6 e il KAND 11 non hanno influenzato la crescita delle cellule HeLa o E. coli a concentrazioni di 100 μM (Fig. 5d, e).
Inibizione della crescita di KAND 11 in organismi non Arabidopsis.(a) Piantine di tabacco SR-1 di tipo selvatico di due settimane sono state coltivate su piastre MS posizionate verticalmente contenenti 25 μM KAND 11. (b) Piantine di tabacco SR-1 di tipo selvatico di due settimane sono state coltivate su piastre MS posizionate orizzontalmente Piastre MS contenenti 200 μM di KAND 11. ( c ) Gemme di epatica Tak-1 di tipo selvatico di due settimane coltivate su piastre Gamborg B5 con le concentrazioni indicate di KAND 11. Le frecce rosse indicano spore che hanno smesso di crescere entro le due settimane di incubazione periodo.(d) Test di proliferazione cellulare delle cellule HeLa.Il numero di cellule vitali è stato misurato a intervalli di tempo fissi utilizzando un kit di conteggio delle cellule 8 (Dojindo).Come controllo, le cellule HeLa sono state trattate con 5 μg/ml di actinomicina D (Act D), che inibisce la trascrizione della RNA polimerasi e provoca la morte cellulare.Le analisi sono state eseguite in triplicato.(e) Test di proliferazione cellulare di E. coli.La crescita di E. coli è stata analizzata misurando OD600.Come controllo, le cellule sono state trattate con 50 μg/ml di ampicillina (Amp), che inibisce la sintesi della parete cellulare batterica.Le analisi sono state eseguite in triplicato.
Per decifrare il meccanismo d'azione della citotossicità causata dai composti correlati all'uramide, abbiamo rianalizzato i derivati dell'acido urbenico con effetti inibitori moderati.come mostrato nell'immagine.Come mostrato nelle Figure 2b, 6a, le piantine coltivate su piastre di agar contenenti alte concentrazioni (200 μM) di acido urmotonico 6 hanno prodotto radici più corte e curve a sinistra (θ = – 23,7 ± 6,1), mentre delle piantine coltivate sul mezzo di controllo, la le piantine hanno prodotto radici quasi diritte (θ = – 3,8 ± 7,1).È noto che questa caratteristica crescita obliqua deriva dalla disfunzione dei microtubuli corticali14,18.Coerentemente con questo risultato, i farmaci destabilizzanti i microtubuli disopiramide e orizalina hanno indotto un'inclinazione radicale simile nelle nostre condizioni di crescita (Figg. 2b, 6a).Allo stesso tempo, abbiamo testato i derivati dell’acido urmotonico e ne abbiamo selezionati diversi che, a determinate concentrazioni, inducono la crescita obliqua delle radici.I composti 8, 9 e 15 hanno cambiato la direzione della crescita delle radici rispettivamente a 75 μM, 50 μM e 40 μM, indicando che questi composti possono destabilizzare efficacemente i microtubuli (Fig. 2b, 6a).Abbiamo anche testato il più potente derivato dell’acido ursolico, KAND 11, a una concentrazione inferiore (15 µM) e abbiamo scoperto che l’applicazione di KAND 11 inibiva la crescita delle radici e che la direzione della crescita delle radici era irregolare, sebbene tendessero a inclinarsi verso sinistra ( Figura C3)..Poiché concentrazioni più elevate di farmaci destabilizzanti i microtubuli a volte inibiscono la crescita delle piante piuttosto che causare l'inclinazione delle radici, abbiamo successivamente valutato la possibilità che KAND 11 influenzi i microtubuli osservando i microtubuli corticali nelle cellule epidermiche delle radici.L'immunoistochimica utilizzando anticorpi anti-β-tubulina nelle cellule epidermiche delle radici delle piantine trattate con 25 μM di KAND 11 ha mostrato la scomparsa di quasi tutti i microtubuli corticali nelle cellule epidermiche nella zona di allungamento (Fig. 6b).Questi risultati indicano che l'acido kumamotonico e i suoi derivati agiscono direttamente o indirettamente sui microtubuli per distruggerli e che questi composti sono nuovi inibitori dei microtubuli.
L'acido ursonico e i suoi derivati alterano i microtubuli corticali nell'Arabidopsis thaliana.(a) Angolo di inclinazione della radice misurato in presenza di vari derivati dell'acido urmotonico alle concentrazioni indicate.Sono stati analizzati anche gli effetti di due composti noti per inibire i microtubuli: disopiramide e orizalina.L'inserto mostra lo standard utilizzato per misurare l'angolo di crescita delle radici.Gli asterischi indicano differenze significative con il trattamento fittizio (t test, p<0,05).n>19. Barra della scala = 1 cm.(b) Microtubuli corticali nelle cellule epidermiche nella zona di allungamento.I microtubuli nelle radici di Arabidopsis Col di tipo selvatico coltivate su piastre MS con o senza KAND 11 da 25 μM sono stati visualizzati mediante colorazione immunoistochimica utilizzando anticorpi primari β-tubulina e anticorpi secondari coniugati con Alexa Fluor.Barra della scala = 10 µm.(c) Struttura mitotica dei microtubuli nel meristema della radice.I microtubuli sono stati visualizzati mediante colorazione immunoistochimica.Le strutture mitotiche, comprese le zone profase, i fusi e i fragmoplasti, sono state contate dalle immagini confocali.Le frecce indicano le strutture dei microtubuli mitotici.Gli asterischi indicano differenze significative con il trattamento fittizio (t test, p<0,05).n>9. Barra della scala = 50 µm.
Sebbene Ursa abbia la capacità di interrompere la funzione dei microtubuli, si prevede che il suo meccanismo d'azione sia diverso dai tipici agenti di depolimerizzazione dei microtubuli.Ad esempio, concentrazioni più elevate di agenti depolimerizzanti dei microtubuli come disopiramide e orizalina inducono un'espansione anisotropa delle cellule epidermiche, mentre KAND 11 no.Inoltre, la co-applicazione di KAND 11 e disopiramide ha prodotto una risposta combinata di crescita delle radici indotta da disopiramide ed è stata osservata un'inibizione della crescita indotta da KAND 11 (Fig. S4).Abbiamo anche analizzato la risposta del mutante ipersensibile disopiramide 1-1 (phs1-1) a KAND 11. phs1-1 ha una mutazione puntiforme non canonica della tubulina chinasi e produce radici più corte quando trattato con disopiramide9,20.Le piantine mutanti phs1-1 coltivate su terreno di agar contenente KAND 11 avevano radici più corte simili a quelle coltivate su disopiramide (fig. S5).
Inoltre, abbiamo osservato strutture di microtubuli mitotici, come zone di profase, fusi e fragmoplasti, nel meristema radicale delle piantine trattate con KAND 11. Coerentemente con le osservazioni per CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS, una diminuzione significativa di è stato osservato il numero di microtubuli mitotici (Fig. 6c).
Per caratterizzare la citotossicità di KAND 11 a risoluzione subcellulare, abbiamo trattato le cellule in sospensione BY-2 di tabacco con KAND 11 e osservato la loro risposta.Per prima cosa abbiamo aggiunto KAND 11 alle cellule BY-2 che esprimono TagRFP-TUA6, che etichetta in modo fluorescente i microtubuli, per valutare l'effetto di KAND 11 sui microtubuli corticali.La densità dei microtubuli corticali è stata valutata utilizzando l'analisi delle immagini, che ha quantificato la percentuale di pixel citoscheletrici tra i pixel citoplasmatici.I risultati del test hanno mostrato che dopo il trattamento con 50 μM o 100 μM di KAND 11 per 1 ora, la densità è diminuita significativamente rispettivamente a 0,94 ± 0,74% o 0,23 ± 0,28%, mentre la densità delle cellule trattate con DMSO ammontava a 1,61 ± 0,34 % (figura 7a).Questi risultati sono coerenti con l'osservazione in Arabidopsis secondo cui il trattamento con KAND 11 induce la depolimerizzazione dei microtubuli corticali (Fig. 6b).Abbiamo anche esaminato la linea BY-2 con filamenti di actina marcati con GFP-ABD dopo il trattamento con la stessa concentrazione di KAND 11 e abbiamo osservato che il trattamento con KAND 11 ha interrotto i filamenti di actina.Il trattamento con KAND 11 da 50 μM o 100 μM per 1 ora ha ridotto significativamente la densità dei filamenti di actina rispettivamente a 1,20 ± 0,62% o 0,61 ± 0,26%, mentre la densità nelle cellule trattate con DMSO era 1,69 ± 0,51% (Fig. 2).7b).Questi risultati contrastano con gli effetti della propizamide, che non influisce sui filamenti di actina, e della latrunculina B, un depolimerizzatore di actina che non influisce sui microtubuli (SI Figura S6).Inoltre, il trattamento con cumamonamide 1, cumamonamide acido 6 o KAND 11 non ha influenzato i microtubuli nelle cellule HeLa (Figura SI S7).Pertanto, si ritiene che il meccanismo d'azione di KAND 11 sia diverso da quello dei noti interferenti del citoscheletro.Inoltre, la nostra osservazione al microscopio delle cellule BY-2 trattate con KAND 11 ha rivelato l'inizio della morte cellulare durante il trattamento con KAND 11 e ha mostrato che la proporzione di cellule morte colorate di blu di Evans non aumentava significativamente dopo 30 minuti di trattamento con KAND 11, mentre dopo 90 minuti di trattamento con KAND da 50 μM o 100 μM, il numero di cellule morte è aumentato rispettivamente al 43,7% o all'80,1% (Fig. 7c).Presi insieme, questi dati indicano che il nuovo derivato dell’acido ursolico KAND 11 è un inibitore citoscheletrico specifico della pianta con un meccanismo d’azione precedentemente sconosciuto.
KAND colpisce i microtubuli corticali, i filamenti di actina e la vitalità delle cellule BY-2 del tabacco.(a) Visualizzazione dei microtubuli corticali nelle cellule BY-2 in presenza di TagRFP-TUA6.Le cellule BY-2 trattate con KAND 11 (50 μM o 100 μM) o DMSO sono state esaminate mediante microscopia confocale.La densità dei microtubuli corticali è stata calcolata dalle micrografie di 25 cellule indipendenti.Le lettere indicano differenze significative (test Tukey HSD, p<0,05).Barra della scala = 10 µm.(b) Filamenti di actina corticale nelle cellule BY-2 visualizzati in presenza di GFP-ABD2.Le cellule BY-2 trattate con KAND 11 (50 μM o 100 μM) o DMSO sono state esaminate mediante microscopia confocale.La densità dei filamenti di actina corticale è stata calcolata dalle micrografie di 25 cellule indipendenti.Le lettere indicano differenze significative (test Tukey HSD, p<0,05).Barra della scala = 10 µm.(c) Osservazione delle cellule BY-2 morte mediante colorazione blu di Evans.Le cellule BY-2 trattate con KAND 11 (50 μM o 100 μM) o DMSO sono state esaminate mediante microscopia a campo chiaro.n=3.Barra della scala = 100 µm.
La scoperta e l’applicazione di nuovi prodotti naturali ha portato a progressi significativi in vari aspetti della vita umana, tra cui la medicina e l’agricoltura.Sono state condotte ricerche storiche per ottenere composti utili dalle risorse naturali.In particolare, gli attinomiceti sono noti per essere utili come antibiotici antiparassitari per i nematodi grazie alla loro capacità di produrre vari metaboliti secondari come l'avermectina, il composto principale dell'ivermectina e della bleomicina e suoi derivati, utilizzato in medicina come agente antitumorale21,22.Allo stesso modo, sono stati scoperti numerosi composti erbicidi dagli attinomiceti, alcuni dei quali sono già utilizzati commercialmente1,23.Pertanto, l'analisi dei metaboliti degli attinomiceti per isolare prodotti naturali con attività biologiche desiderate è considerata una strategia efficace.In questo studio, abbiamo scoperto un nuovo composto, la cumamonamide, proveniente da S. werraensis e lo abbiamo sintetizzato con successo.L'acido ursonico è un intermedio sintetico dell'urbenamide e dei suoi derivati.Può causare il caratteristico arricciamento delle radici, esibire un'attività erbicida da moderata a forte e danneggiare direttamente o indirettamente i microtubuli delle piante.Tuttavia, il meccanismo d’azione dell’acido urmotonico può differire da quello degli inibitori dei microtubuli esistenti, poiché KAND 11 distrugge anche i filamenti di actina e provoca la morte cellulare, suggerendo un meccanismo di regolazione attraverso il quale l’acido urmotonico e i suoi derivati influenzano un’ampia gamma di strutture citoscheletriche..
Un'ulteriore caratterizzazione dettagliata dell'acido urbenonico aiuterà a comprendere meglio il meccanismo d'azione dell'acido urbenonico.In particolare, il prossimo obiettivo è valutare la capacità dell'acido ursonico di legarsi ai microtubuli ridotti per determinare se l'acido ursonico e i suoi derivati agiscono direttamente sui microtubuli e li depolimerizzano, o se la loro azione determina una destabilizzazione dei microtubuli.Inoltre, nel caso in cui i microtubuli non siano un bersaglio diretto, l’identificazione del sito d’azione e dei bersagli molecolari dell’acido ursonico sulle cellule vegetali aiuterà a comprendere ulteriormente le proprietà dei composti correlati e i possibili modi per migliorare l’attività erbicida.Il nostro test di bioattività ha rivelato la capacità citotossica unica dell’acido ursonico sulla crescita di piante come Arabidopsis thaliana, tabacco ed erba epatica, mentre né E. coli né cellule HeLa sono state colpite.Una tossicità minima o nulla per le cellule animali è un vantaggio dei derivati dell'acido ursonico se vengono sviluppati come erbicidi per l'uso in campi agricoli aperti.Infatti, poiché i microtubuli sono strutture comuni negli eucarioti, la loro inibizione selettiva nelle piante è un requisito fondamentale per gli erbicidi.Ad esempio, la propizamide, un agente depolimerizzante dei microtubuli che si lega direttamente alla tubulina e inibisce la polimerizzazione, viene utilizzato come erbicida grazie alla sua bassa tossicità per le cellule animali24.A differenza della disopiramide, le benzamidi correlate hanno specificità target diverse.Oltre ai microtubuli vegetali, l'RH-4032 o la benzoxamide inibiscono anche i microtubuli delle cellule animali o degli oomiceti, rispettivamente, e la zalilamide viene utilizzata come fungicida a causa della sua bassa fitotossicità25,26,27.L'orso appena scoperto e i suoi derivati mostrano citotossicità selettiva contro le piante, ma vale la pena notare che ulteriori modifiche possono alterare la loro specificità target, fornendo potenzialmente derivati aggiuntivi per il controllo di funghi patogeni o oomiceti.
Le proprietà uniche dell'acido urbenonico e dei suoi derivati sono utili per il loro sviluppo come erbicidi e per l'utilizzo come strumenti di ricerca.L’importanza del citoscheletro nel controllo della forma delle cellule vegetali è ampiamente riconosciuta.Studi precedenti hanno dimostrato che le piante hanno sviluppato meccanismi complessi di organizzazione dei microtubuli corticali controllando la dinamica dei microtubuli per controllare adeguatamente la morfogenesi.È stato identificato un gran numero di molecole responsabili della regolazione dell'attività dei microtubuli e la ricerca correlata è ancora in corso3,4,28.La nostra attuale comprensione della dinamica dei microtubuli nelle cellule vegetali non spiega completamente i meccanismi dell'organizzazione dei microtubuli corticali.Ad esempio, sebbene sia la disopiramide che l'orizalina possano depolimerizzare i microtubuli, la disopiramide provoca una grave distorsione delle radici mentre l'orizalina ha un effetto relativamente lieve.Inoltre, le mutazioni nella tubulina, che stabilizza i microtubuli, causano anche la destrorotazione nelle radici, mentre il paclitaxel, che stabilizza anche la dinamica dei microtubuli, no.Pertanto, lo studio e l'identificazione dei bersagli molecolari dell'acido ursolico dovrebbero fornire nuove informazioni sulla regolazione dei microtubuli corticali delle piante.Allo stesso modo, i futuri confronti tra sostanze chimiche efficaci nel promuovere una crescita distorta, come la disopiramide, e sostanze chimiche meno efficaci, come l’orizalina o l’acido kumamotorio, forniranno indizi su come avviene la crescita distorta.
D'altra parte, i riarrangiamenti citoscheletrici legati alla difesa sono un'altra possibilità per spiegare la citotossicità dell'acido ursonico.L'infezione di un agente patogeno o l'introduzione di un elicitore nelle cellule vegetali talvolta provoca la distruzione del citoscheletro e la successiva morte cellulare29.Ad esempio, è stato segnalato che la criptoxantina derivata dagli oomiceti distrugge i microtubuli e i filamenti di actina prima della morte delle cellule del tabacco, in modo simile a quanto accade con il trattamento KAND30,31.Le somiglianze tra le risposte di difesa e le risposte cellulari indotte dall'acido ursonico ci hanno portato a ipotizzare che innescano processi cellulari comuni, sebbene sia evidente un effetto più rapido e più forte dell'acido ursonico rispetto alla criptoxantina.Tuttavia, gli studi hanno dimostrato che la rottura dei filamenti di actina promuove la morte cellulare spontanea, che non è sempre accompagnata dalla rottura dei microtubuli29.Inoltre, resta da vedere se l’agente patogeno o l’elicitore causano una crescita distorta delle radici, come fanno i derivati dell’acido ursonico.Pertanto, la conoscenza molecolare che collega le risposte di difesa e il citoscheletro rappresenta un problema interessante da affrontare.Sfruttando la presenza di composti a basso peso molecolare correlati all'acido ursonico, nonché di una serie di derivati con potenze variabili, potrebbero offrire l'opportunità di colpire meccanismi cellulari sconosciuti.
Nel loro insieme, la scoperta e l'applicazione di nuovi composti che modulano la dinamica dei microtubuli forniranno metodi potenti per affrontare i complessi meccanismi molecolari alla base della determinazione della forma delle cellule vegetali.In questo contesto, il composto acido urmotonico recentemente sviluppato, che colpisce i microtubuli e i filamenti di actina e induce la morte cellulare, può fornire l’opportunità di decifrare la connessione tra il controllo dei microtubuli e questi altri meccanismi.Pertanto, l'analisi chimica e biologica utilizzando l'acido urbenonico ci aiuterà a comprendere i meccanismi di regolazione molecolare che controllano il citoscheletro vegetale.
Inoculare S. werraensis MK493-CF1 in una beuta Erlenmeyer con deflettore da 500 mL contenente 110 mL di mezzo di semina costituito da 2% (p/v) galattosio, 2% (p/v) pasta Essence, 1% (p/v) composizione Bacto .-soia (Thermo Fisher Scientific, Inc.), estratto di mais allo 0,5% (p/v) (KOGOSTCH Co., Ltd., Giappone), 0,2% (p/v) (NH4)2SO4 e 0,2% CaCO3 in acqua deionizzata.(pH 7,4 prima della sterilizzazione).Le colture di semi sono state incubate su un agitatore rotante (180 giri al minuto) a 27°C per 2 giorni.Coltivazione produttiva tramite fermentazione allo stato solido.La coltura del seme (7 ml) è stata trasferita in un pallone K-1 da 500 ml contenente 40 g di mezzo di produzione costituito da 15 g di orzo pressato (MUSO Co., Ltd., Giappone) e 25 g di acqua deionizzata (pH non regolato prima della sterilizzazione).).La fermentazione è stata condotta a 30°C al buio per 14 giorni.Il materiale di fermentazione è stato estratto con 40 ml/bottiglia di EtOH e centrifugato (1500 g, 4°C, 10 min).Il surnatante della coltura (60 ml) è stato estratto con una miscela di MeOH/EtOAc al 10%.Lo strato organico è stato evaporato a pressione ridotta per ottenere un residuo (59,5 mg), che è stato sottoposto a HPLC con eluizione in gradiente (0–10 minuti: 90%) su una colonna a fase inversa (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 μm, ID 10 mm × lunghezza 250 mm) H2O/CH3CN, 10–35 minuti: da 90% H2O/CH3CN a 70% H2O/CH3CN (gradiente), 35–45 minuti: 90% H2O/EtOH, 45–155 minuti: 90% H2O /EtOH a 100% EtOH (gradiente (gradiente), 155–200 min: 100% EtOH) a una portata di 1,5 ml/min, la cumamonamide (1, 36,0 mg) è stata isolata come polvere amorfa bianca.
Kumamotoamide(1);1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6,93 (t, J = 2,5 Hz, 1H), 6,76 (dd, J = 4,3, 1,8 Hz 1H), 6,05 (t, J = 3,8 Hz, 1H).), 4.08 (s, 3H);13C-NMR (125 MHz, CDCl3) δ 161,1, 121,0, 119,9, 112,2, 105,0, 68,3;ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ valore calcolato: 141,0659, valore misurato: 141,0663, IR νmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 1537 cm–1.
I semi di Columbia (Col-0) sono stati ottenuti dall'Arabidopsis Biological Resource Center (ABRC) con il permesso per l'uso nella ricerca.I semi di Col-0 sono stati propagati e mantenuti nelle nostre condizioni di laboratorio e utilizzati come piante di Arabidopsis di tipo selvatico.I semi di Arabidopsis sono stati sterilizzati in superficie e coltivati in terreno Murashige e Skoog a metà concentrazione contenente il 2% di saccarosio (Fujifilm Wako Pure Chemical), lo 0,05% (p/v) di acido 2-(4-morfolino)etansolfonico (MES) (Fujifilm Wako Pure Chemical ).) e agar all'1,5% (Fujifilm Wako Pure Chemical), pH 5,7, a 23 °C e luce costante.I semi del mutante phs1-1 sono stati forniti da T. Hashimoto (Nara Institute of Science and Technology).
I semi del ceppo SR-1 sono stati forniti da T. Hashimoto (Istituto di Scienza e Tecnologia di Nara) e utilizzati come piante di tabacco di tipo selvatico.I semi di tabacco sono stati sterilizzati in superficie e immersi in acqua sterile per tre notti per favorire la germinazione, quindi posti in una soluzione a metà concentrazione contenente 2% saccarosio, 0,05% (p/v) MES e 0,8% gomma di gellano (Fujifilm Wako Pure Chemical) Murashige.e terreno Skoog) con pH 5,7 e incubato a 23°C sotto luce costante.
Il ceppo Tak-1 è stato fornito da T. Kohchi (Università di Kyoto) ed è stato utilizzato come unità sperimentale standard per lo studio sull'erba epatica.Gemma è stata ottenuta da piante in coltura sterilizzate e poi piastrate su terreno Gamborg B5 (Fujifilm Wako Pure Chemical) contenente 1% di saccarosio e 0,3% di gomma di gellano e incubata a 23°C sotto luce continua.
Le cellule di tabacco BY-2 (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2) sono state fornite da S. Hasezawa (Università di Tokyo).Le cellule BY-2 sono state diluite 95 volte in mezzo Linsmeier e Skoog modificato e integrate settimanalmente con acido 2,4-diclorofenossiacetico 32.La sospensione cellulare è stata miscelata su un agitatore rotante a 130 giri al minuto a 27°C al buio.Lavare le cellule con 10 volte il volume di mezzo fresco e risospendere nello stesso mezzo.Le linee cellulari transgeniche BY-2 che esprimono stabilmente il marcatore dei microtubuli TagRFP-TUA6 o il marcatore del filamento di actina GFP-ABD2 sotto il promotore 35S del virus del mosaico del cavolfiore sono state generate come descritto33,34,35.Queste linee cellulari possono essere mantenute e sincronizzate utilizzando procedure simili a quelle utilizzate per la linea cellulare BY-2 originale.
Le cellule HeLa sono state coltivate nel terreno Eagle modificato di Dulbecco (DMEM) (Life Technologies) integrato con il 10% di siero bovino fetale, 1,2 U/ml di penicillina e 1,2 μg/ml di streptomicina in un incubatore a 37°C con il 5% di CO2.
Tutti gli esperimenti descritti in questo manoscritto sono stati eseguiti in conformità con le normative e le linee guida giapponesi sulla biosicurezza.
I composti sono stati sciolti in dimetilsolfossido (DMSO; Fujifilm Wako Pure Chemical) come soluzioni madre e diluiti in terreno MS per Arabidopsis e tabacco o terreno Gamborg B5 per epatica.Per il test di inibizione della crescita delle radici, più di 10 semi per piastra sono stati seminati su terreno di agar contenente i composti indicati o DMSO.I semi sono stati incubati in una camera di crescita per 7 giorni.Le piantine sono state fotografate ed è stata misurata la lunghezza delle radici.Per il test di germinazione dell'Arabidopsis, 48 semi per piastra sono stati seminati su terreno di agar contenente 200 μM di composto o DMSO.I semi di Arabidopsis sono stati coltivati in una camera di crescita e il numero di piantine germinate è stato contato 7 giorni dopo la germinazione (dag).Per il test di germinazione del tabacco, 24 semi per piastra sono stati seminati su terreno di agar contenente 200 μM di KAND o DMSO.I semi di tabacco sono stati coltivati in una camera di crescita e il numero di piantine germinate è stato contato dopo 14 giorni.Per il test di inibizione della crescita dell'erba epatica, 9 embrioni da ciascuna piastra sono stati piastrati su terreno di agar contenente le concentrazioni indicate di KAND o DMSO e incubati in una camera di crescita per 14 giorni.
Utilizzare piantine colorate con 5 mg/ml di ioduro di propidio (PI) per visualizzare l'organizzazione del meristema radicale.I segnali PI sono stati osservati mediante microscopia a fluorescenza utilizzando un microscopio confocale a scansione laser TCS SPE (Leica Microsystems).
La colorazione istochimica delle radici con β-glucuronidasi (GUS) è stata eseguita secondo il protocollo descritto da Malami e Benfey36.Le piantine sono state fissate in acetone al 90% durante la notte, colorate con 0,5 mg/ml di acido 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-d-glucuronico in tampone GUS per 1 ora e poste in una soluzione idrata di cloraldeide.(8 g di cloralio idrato, 2 ml di acqua e 1 ml di glicerolo) e osservati mediante microscopia a contrasto di interferenza differenziale utilizzando un microscopio Axio Imager M1 (Carl Zeiss).
Gli angoli delle radici sono stati misurati su piantine di 7 giorni coltivate su piastre posizionate verticalmente.Misurare l'angolo della radice dalla direzione del vettore gravità come descritto al punto 6.
La disposizione dei microtubuli corticali è stata osservata come descritto, con piccole modifiche al protocollo 37.L'anticorpo anti-β-tubulina (KMX-1, Merk Millipore: MAB3408) e le IgG anti-topo coniugate con Alexa Fluor 488 (Thermo Fisher Scientific: A32723) sono stati utilizzati come anticorpi primari e secondari a diluizioni 1:1000 e 1:100, rispettivamente.Le immagini in fluorescenza sono state acquisite utilizzando un microscopio confocale a scansione laser TCS SPE (Leica Microsystems).Acquisisci immagini Z-stack e crea proiezioni di massima intensità secondo le istruzioni del produttore.
Il test di proliferazione delle cellule HeLa è stato eseguito utilizzando Cell Counting Kit 8 (Dojindo) secondo le istruzioni del produttore.
La crescita di E. coli DH5α è stata analizzata misurando la densità cellulare in coltura utilizzando uno spettrofotometro a 600 nm (OD600).
L'organizzazione citoscheletrica nelle cellule transgeniche BY-2 è stata osservata utilizzando un microscopio a fluorescenza dotato di un dispositivo di scansione confocale CSU-X1 (Yokogawa) e una fotocamera sCMOS (Zyla, Andor Technology).La densità citoscheletrica è stata valutata mediante analisi delle immagini, che ha quantificato la percentuale di pixel citoscheletrici tra i pixel citoplasmatici nelle immagini confocali utilizzando il software ImageJ come descritto38,39.
Per rilevare la morte cellulare nelle cellule BY-2, un'aliquota della sospensione cellulare è stata incubata con blu Evans allo 0,05% per 10 minuti a temperatura ambiente.La colorazione selettiva con blu Evans delle cellule morte dipende dall'estrusione del colorante dalle cellule vitali da parte della membrana plasmatica intatta40.Le cellule colorate sono state osservate utilizzando un microscopio a campo chiaro (BX53, Olympus).
Le cellule HeLa sono state coltivate in DMEM integrato con il 10% di FBS in un incubatore umidificato a 37°C e il 5% di CO2.Le cellule sono state trattate con 100 μM di KAND 11, acido kumamonamico 6, kumamonamide 1, 100 ng/ml di colcemid (Gibco) o 100 ng/ml di Nocodmaze (Sigma) per 6 ore a 37°C.Le cellule sono state fissate con MetOH per 10 minuti e poi con acetato per 5 minuti a temperatura ambiente.Le cellule fissate sono state incubate con l'anticorpo primario β-tubulina (1D4A4, Proteintech: 66240-1) diluito in BSA/PBS allo 0,5% per 2 ore, lavate 3 volte con TBST e quindi incubate con anticorpo di capra Alexa Fluor.488 1 ora.– IgG di topo (Thermo Fisher Scientific: A11001) e 15 ng/ml 4′,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) diluiti in BSA/PBS allo 0,5%.Dopo il lavaggio con TBST tre volte, le cellule colorate sono state osservate su un microscopio invertito Nikon Eclipse Ti-E.Le immagini sono state catturate con una fotocamera CCD Hamamatsu ORCA-R2 raffreddata utilizzando il software MetaMorph (Molecular Devices).
Orario di pubblicazione: 17 giugno 2024