Grazie per aver visitato Nature.com. La versione del browser che stai utilizzando ha un supporto CSS limitato. Per ottenere risultati ottimali, ti consigliamo di utilizzare una versione più recente del tuo browser (o di disabilitare la Modalità di compatibilità in Internet Explorer). Nel frattempo, per garantire il supporto continuo, il sito viene visualizzato senza stili o JavaScript.
La scoperta e l'uso benefico di prodotti naturali possono contribuire a migliorare la vita umana. Le sostanze chimiche inibitrici della crescita delle piante sono ampiamente utilizzate come erbicidi per il controllo delle infestanti. Data la necessità di utilizzare diversi tipi di erbicidi, è necessario identificare composti con nuovi meccanismi d'azione. In questo studio, abbiamo scoperto un nuovo composto N-alcossipirrolico, la coumamonamide, da Streptomyces werraensis MK493-CF1 e abbiamo stabilito il processo di sintesi completo. Attraverso saggi di attività biologica, abbiamo scoperto che l'acido urs-monoammico è un intermedio di sintesi dell'urs-monoamide e un potenzialeinibitore della crescita delle pianteInoltre, abbiamo sviluppato diversi derivati dell'acido urbenonico, tra cui il derivato urbenilossi (UDA), che presenta un'elevata attività erbicida senza influenzare negativamente la crescita delle cellule HeLa. Abbiamo anche scoperto che i derivati dell'acido urmotonico interrompono i microtubuli delle piante; inoltre, il KAND influenza i filamenti di actina e induce la morte cellulare. Questi effetti multiformi differiscono da quelli dei noti inibitori dei microtubuli e suggeriscono un nuovo meccanismo d'azione per l'acido ursonico, che rappresenta un importante vantaggio nello sviluppo di nuovi erbicidi.
La scoperta e l'applicazione pratica di prodotti naturali benefici e dei loro derivati è un mezzo per migliorare la qualità della vita umana. I metaboliti secondari prodotti da microrganismi, piante e insetti hanno portato a importanti progressi in medicina e agricoltura. Molti antibiotici e farmaci antileucemici sono stati sviluppati a partire da prodotti naturali. Inoltre, vari tipi dipesticidiDa questi prodotti naturali si estraggono fungicidi ed erbicidi per l'uso in agricoltura. In particolare, gli erbicidi per il controllo delle infestanti sono strumenti importanti per aumentare le rese delle colture nell'agricoltura moderna e diversi tipi di composti sono già utilizzati commercialmente. Diversi processi cellulari nelle piante, come la fotosintesi, il metabolismo degli amminoacidi, la sintesi della parete cellulare, la regolazione della mitosi, la segnalazione dei fitormoni o la sintesi proteica, sono considerati bersagli tipici degli erbicidi. I composti che inibiscono la funzione dei microtubuli sono una classe comune di erbicidi che influenzano la crescita delle piante agendo sulla regolazione mitotica².
I microtubuli sono componenti del citoscheletro e sono ampiamente conservati nelle cellule eucariotiche. L'eterodimero della tubulina è costituito da α-tubulina e β-tubulina che formano protofilamenti lineari, con 13 protofilamenti che formano una struttura cilindrica. I microtubuli svolgono molteplici ruoli nelle cellule vegetali, tra cui la determinazione della forma cellulare, la divisione cellulare e il trasporto intracellulare3,4. Le cellule vegetali contengono microtubuli al di sotto della membrana plasmatica in interfase, e si ritiene che questi cosiddetti microtubuli corticali controllino l'organizzazione delle microfibrille di cellulosa attraverso la regolazione dei complessi della cellulosa sintasi4,5. I microtubuli corticali delle cellule epidermiche della radice, presenti nella zona di rapido allungamento dell'apice radicale, sono localizzati lateralmente, e le microfibre di cellulosa seguono questi microtubuli limitando la direzione dell'espansione cellulare, promuovendo così un allungamento cellulare anisotropo. Pertanto, la funzione dei microtubuli è strettamente correlata alla morfologia vegetale. Le sostituzioni di amminoacidi nei geni che codificano la tubulina causano una distorsione degli array di microtubuli corticali e una crescita obliqua a sinistra o a destra in Arabidopsis 6,7. Allo stesso modo, le mutazioni nelle proteine associate ai microtubuli che regolano la dinamica dei microtubuli possono anche portare a una crescita distorta delle radici8,9,10,11,12,13. Inoltre, il trattamento con erbicidi che interrompono i microtubuli, come la disopiramide, nota anche come pretilaclor, causa anch'esso una crescita obliqua delle radici a sinistra14. Questi dati indicano che una regolazione precisa della funzione dei microtubuli è fondamentale per determinare la direzione della crescita delle piante.
Sono stati scoperti diversi tipi di inibitori dei microtubuli, e questi farmaci hanno dato un contributo significativo alla ricerca sul citoscheletro, nonché all'agricoltura e alla medicina². In particolare, l'orizalina, i composti dinitroanilinici, la disopiramide, i composti correlati alla benzammide e i loro analoghi possono inibire la funzione dei microtubuli e quindi inibire la crescita delle piante. Pertanto, sono ampiamente utilizzati come erbicidi. Tuttavia, poiché i microtubuli sono una componente importante delle cellule vegetali e animali, la maggior parte degli inibitori dei microtubuli è citotossica per entrambi i tipi di cellule. Pertanto, nonostante la loro riconosciuta utilità come erbicidi, un numero limitato di agenti antimicrotubulari viene utilizzato per scopi pratici.
Streptomyces è un genere della famiglia Streptomyces, che comprende batteri aerobi, Gram-positivi, filamentosi ed è ampiamente noto per la sua capacità di produrre una vasta gamma di metaboliti secondari. Pertanto, è considerato una delle fonti più importanti di nuovi prodotti naturali biologicamente attivi. Nel presente studio, abbiamo scoperto un nuovo composto chiamato coumamonamide, isolato da Streptomyces werraensis MK493-CF1 e S. werraensis ISP 5486. Utilizzando l'analisi spettrale e l'analisi spettrale completa, è stata caratterizzata la struttura della coumamonamide ed è stato determinato il suo scheletro N-alcossipirrolico unico. L'acido ursmonico, un intermedio di sintesi dell'ursmonoamide e dei suoi derivati, ha dimostrato di inibire la crescita e la germinazione della popolare pianta modello Arabidopsis thaliana. In uno studio di relazione struttura-attività, abbiamo scoperto che un composto con C9 modificato in acido ursonico, chiamato derivato nonilossi dell'acido ursonico (KAND), aumenta significativamente l'effetto inibitorio sulla crescita e sulla germinazione. In particolare, il nuovo inibitore della crescita vegetale ha influenzato anche la crescita del tabacco e dell'epatica e non è risultato citotossico per i batteri o le cellule HeLa. Inoltre, alcuni derivati dell'acido urmotonico inducono un fenotipo radicale distorto, il che implica che questi derivati influenzino direttamente o indirettamente i microtubuli. In linea con questa ipotesi, le nostre osservazioni sui microtubuli marcati mediante immunoistochimica o con proteine fluorescenti indicano che il trattamento con KAND depolimerizza i microtubuli. Inoltre, il trattamento con derivati dell'acido kumamotonico ha alterato i microfilamenti di actina. Pertanto, abbiamo scoperto un nuovo inibitore della crescita vegetale il cui meccanismo d'azione unico prevede la distruzione del citoscheletro.
Il ceppo MK493-CF1 è stato isolato da un campione di terreno nel distretto di Shinagawa-ku, a Tokyo. Il ceppo MK493-CF1 ha formato un micelio stromale ben ramificato. È stata determinata la sequenza parziale del gene dell'RNA ribosomiale 16S (1422 bp). Questo ceppo è molto simile a S. werraensis (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 bp, T: ceppo tipico, 99,93%). Sulla base di questo risultato, è stato stabilito che questo ceppo è strettamente correlato al ceppo tipo di S. werraensis. Pertanto, abbiamo provvisoriamente denominato questo ceppo S. werraensis MK493-CF1. Anche S. werraensis ISP 5486T produce gli stessi composti bioattivi. Dato che in passato erano state condotte poche ricerche sull'ottenimento di prodotti naturali da questo microrganismo, sono state effettuate ulteriori ricerche chimiche. Dopo la coltivazione di S. werraensis MK493-CF1 su terreno d'orzo mediante fermentazione allo stato solido a 30 °C per 14 giorni, il terreno è stato estratto con etanolo al 50%. 60 ml di campione sono stati essiccati per ottenere 59,5 mg di estratto grezzo. L'estratto grezzo è stato sottoposto a HPLC in fase inversa per ottenere N-metossi-1H-pirrolo-2-carbossammide (1, denominata coumamonamide, 36,0 mg). La quantità totale di 1 è pari a circa il 60% dell'estratto grezzo. Pertanto, abbiamo deciso di studiare in dettaglio le proprietà della kumamotoamide 1.
La coumamonamide 1 è una polvere amorfa bianca e la spettrometria di massa ad alta risoluzione (HRESIMS) conferma C6H8N2O2 (Fig. 1). Il frammento pirrolico sostituito in C2 di questo composto è caratterizzato da δH 6,94 (1H, t, J = 2,8, 4,8 Hz, H-4), δH 6,78 (1H, d, J = 2,5, δH nello spettro 1H NMR: 4,5 Hz, H-5) e δH 6,78 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-6), e lo spettro 13C NMR mostra la presenza di quattro atomi di carbonio sp2. La presenza di un gruppo ammide in posizione C2 è stata valutata mediante correlazione HMBC dal protone C-3 al carbonio carbonilico dell'ammide a δC 161,1. Inoltre, i picchi NMR 1H e 13C a δH 4,10 (3H, S) e δC 68,3 indicano la presenza di gruppi N-metossi nella molecola. Sebbene la posizione corretta del gruppo metossi non fosse ancora stata determinata mediante analisi spettroscopiche come la spettroscopia di differenza potenziata e l'abbreviazione di Overhauser nucleare (NOEDF), la N-metossi-1H-pirrolo-2-carbossammide è diventata il primo composto candidato.
Per determinare la struttura corretta di 1, è stata eseguita una sintesi totale (Fig. 2a). Il trattamento della 2-amminopiridina 2, disponibile in commercio, con m-CPBA ha prodotto il corrispondente N-ossido 3 con resa quantitativa. Dopo la 2-amminoazidazione di 2, la reazione di ciclocondensazione descritta da Abramovich è stata condotta in benzene a 90 °C per ottenere il desiderato 1-idrossi-1H-pirrolo-2-carbonitrile 5 in grammi. Velocità 60% (due fasi). 15,16. La metilazione e l'idrolisi di 4 hanno quindi fornito l'acido 1-metossi-1H-pirrolo-2-carbossilico (denominato "acido cumotonico", 6) con buona resa (70%, due fasi). Infine, l'amidazione tramite l'intermedio cloruro acilico 6 utilizzando ammoniaca acquosa ha fornito l'ammide di Kumamoto 1 con una resa del 98%. Tutti i dati spettrali del composto 1 sintetizzato erano simili a quelli del composto 1 isolato, pertanto è stata determinata la struttura del composto 1;
Sintesi generale e analisi dell'attività biologica dell'urbenamide e dell'acido urbenico. (a) Sintesi totale dell'amide di Kumamoto. (b) Piantine di Arabidopsis Columbia (Col) di tipo selvatico di sette giorni sono state coltivate su piastre di Murashige e Skoog (MS) contenenti coumamonamide 6 o coumamonamide 1 alle concentrazioni indicate. Barra di scala = 1 cm.
Innanzitutto, abbiamo valutato le attività biologiche dell'urbenamide e dei suoi intermedi per la loro capacità di modulare la crescita delle piante. Abbiamo aggiunto varie concentrazioni di ursmonamide 1 o acido ursmonico 6 al terreno di coltura MS agar e coltivato piantine di Arabidopsis thaliana su questo terreno. Questi test hanno mostrato che alte concentrazioni (500 μM) di 6 inibivano la crescita delle radici (Fig. 2b). Successivamente, abbiamo generato vari derivati sostituendo la posizione N1 di 6 e abbiamo eseguito studi di relazione struttura-attività su di essi (il processo di sintesi degli analoghi è descritto nelle Informazioni supplementari (SI)). Le piantine di Arabidopsis sono state coltivate su un terreno contenente 50 μM di derivati dell'acido ursmonico e la lunghezza delle radici è stata misurata, come mostrato nell'immagine. Come mostrato nelle Figure 3a, b e S1, gli acidi coumamo presentano diverse lunghezze di catene alcossiliche lineari (9, 10, 11, 12 e 13) o lunghe catene alcossiliche (15, 16 e 17) in posizione N1. I derivati hanno mostrato una significativa inibizione della crescita delle radici. Inoltre, abbiamo scoperto che l'applicazione di 200 μM di 10, 11 o 17 inibiva la germinazione (Figure 3c e S2).
Studio della relazione struttura-attività dell'ammide di Kumamoto e dei composti correlati. (a) Struttura e schema di sintesi degli analoghi. (b) Quantificazione della lunghezza delle radici di piantine di 7 giorni cresciute su terreno MS con o senza derivati di coumamonamide a 50 μM. Gli asterischi indicano differenze significative con il trattamento fittizio (test t, p< 0,05). n>18. I dati sono mostrati come media ± DS. nt significa "non testato" perché più del 50% dei semi non è germinato. (c) Quantificazione del tasso di germinazione dei semi trattati incubati per 7 giorni in terreno MS con o senza 200 μM di coumamonamide e composti correlati. Gli asterischi indicano differenze significative con il trattamento fittizio (test del chi-quadrato). n=96.
È interessante notare che l'aggiunta di catene laterali alchiliche più lunghe di C9 ha ridotto l'attività inibitoria, suggerendo che i composti correlati all'acido kumamotoico richiedono catene laterali di una certa dimensione per esibire la loro attività biologica.
Poiché l'analisi della relazione struttura-attività ha mostrato che C9 è stato modificato in acido ursonico e che il derivato nonilossi dell'acido ursonico (di seguito denominato KAND 11) era l'inibitore della crescita delle piante più efficace, abbiamo condotto una caratterizzazione più dettagliata di KAND 11. Il trattamento di Arabidopsis con 50 μM di KAND 11 ha impedito quasi completamente la germinazione, mentre concentrazioni inferiori (40, 30, 20 o 10 μM) di KAND 11 hanno inibito la crescita delle radici in modo dose-dipendente (Fig. 4a, b). Per verificare se KAND 11 influisce sulla vitalità del meristema radicale, abbiamo esaminato i meristemi radicali colorati con ioduro di propidio (PI) e misurato la dimensione dell'area del meristema. La dimensione del meristema delle plantule cresciute su un mezzo contenente 25 μM di KAND-11 era di 151,1 ± 32,5 μm, mentre la dimensione del meristema delle plantule cresciute su un mezzo di controllo contenente DMSO era di 264,7 ± 30,8 μm (Fig. 4c, d), il che indica che KAND-11 ripristina l'attività cellulare. diffusione. Meristema radicale. In linea con ciò, il trattamento con KAND 11 ha ridotto la quantità del segnale del marcatore di divisione cellulare CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS nel meristema radicale (Fig. 4e) 17. Questi risultati indicano che KAND 11 inibisce la crescita delle radici riducendo l'attività di proliferazione cellulare.
Analisi dell'effetto inibitorio dei derivati dell'acido urbenonico (derivati urbenilossi) sulla crescita. (a) Piantine di tipo selvatico Col di 7 giorni cresciute su piastre MS con le concentrazioni indicate di KAND 11. Barra di scala = 1 cm. (b) Quantificazione della lunghezza delle radici. Le lettere indicano differenze significative (test HSD di Tukey, p< 0,05). n>16. I dati sono mostrati come media ± DS. (c) Microscopia confocale di radici di tipo selvatico Col colorate con ioduro di propidio cresciute su piastre MS con o senza 25 μM di KAND 11. Le parentesi bianche indicano il meristema radicale. Barra di scala = 100 µm. (d) Quantificazione delle dimensioni del meristema radicale (n = da 10 a 11). Le differenze statistiche sono state determinate utilizzando il test t (p< 0,05). Le barre rappresentano la dimensione media del meristema. (e) Microscopia a contrasto di interferenza differenziale (DIC) di un meristema radicale contenente il costrutto CDKB2; 1pro: CDKB2; 1-GUS colorato e colorato su plantule di 5 giorni cresciute su piastre MS con o senza saggio KAND a 25 µM.
La fitotossicità di KAND 11 è stata ulteriormente testata utilizzando un'altra pianta dicotiledone, il tabacco (Nicotiana tabacum), e un importante organismo modello di pianta terrestre, l'epatica (Marchantia polymorpha). Come nel caso di Arabidopsis, le piantine di tabacco SR-1 cresciute su un mezzo contenente 25 μM di KAND 11 hanno prodotto radici più corte (Fig. 5a). Inoltre, 40 dei 48 semi sono germinati su piastre contenenti 200 μM di KAND 11, mentre tutti i 48 semi sono germinati su mezzi trattati con placebo, indicando che concentrazioni più elevate di KAND erano significative (p< 0,05; test chi quadrato) ha inibito la germinazione del tabacco. (Fig. 5b). Inoltre, la concentrazione di KAND 11 che ha inibito la crescita batterica nell'epatica era simile alla concentrazione efficace in Arabidopsis (Fig. 5c). Questi risultati indicano che KAND 11 può inibire la crescita di una varietà di piante. Abbiamo quindi studiato la possibile citotossicità dei composti correlati alla monoamide in altri organismi, vale a dire cellule HeLa umane e ceppo di Escherichia coli DH5α, come rappresentanti rispettivamente di cellule animali superiori e batteriche. In una serie di test di proliferazione cellulare, abbiamo osservato che la coumamonamide 1, l'acido coumamonamidico 6 e KAND 11 non hanno influenzato la crescita delle cellule HeLa o E. coli a concentrazioni di 100 μM (Fig. 5d,e).
Inibizione della crescita di KAND 11 in organismi non Arabidopsis. (a) Piantine di tabacco SR-1 di tipo selvatico di due settimane sono state coltivate su piastre MS posizionate verticalmente contenenti 25 μM di KAND 11. (b) Piantine di tabacco SR-1 di tipo selvatico di due settimane sono state coltivate su piastre MS posizionate orizzontalmente contenenti 200 μM di KAND 11. (c) Gemme di epatiche Tak-1 di tipo selvatico di due settimane coltivate su piastre Gamborg B5 con le concentrazioni indicate di KAND 11. Le frecce rosse indicano le spore che hanno smesso di crescere entro il periodo di incubazione di due settimane. (d) Saggio di proliferazione cellulare di cellule HeLa. Il numero di cellule vitali è stato misurato a intervalli di tempo fissi utilizzando un kit di conteggio cellulare 8 (Dojindo). Come controllo, le cellule HeLa sono state trattate con 5 μg/ml di actinomicina D (Act D), che inibisce la trascrizione della RNA polimerasi e causa la morte cellulare. Le analisi sono state eseguite in triplicato. (e) Test di proliferazione cellulare di E. coli. La crescita di E. coli è stata analizzata misurando l'OD600. Come controllo, le cellule sono state trattate con 50 μg/ml di ampicillina (Amp), che inibisce la sintesi della parete cellulare batterica. Le analisi sono state eseguite in triplicato.
Per decifrare il meccanismo d'azione della citotossicità causata dai composti correlati all'uramide, abbiamo rianalizzato i derivati dell'acido urbenico con effetti inibitori moderati, come mostrato in figura. Come illustrato nelle Figure 2b e 6a, le piantine cresciute su piastre di agar contenenti alte concentrazioni (200 μM) di acido urmotonico 6 hanno prodotto radici più corte e curve a sinistra (θ = – 23,7 ± 6,1), mentre le piantine cresciute sul mezzo di controllo hanno prodotto radici quasi dritte (θ = – 3,8 ± 7,1). È noto che questa caratteristica crescita obliqua deriva da una disfunzione dei microtubuli corticali14,18. In linea con questo risultato, i farmaci destabilizzanti dei microtubuli disopiramide e orizalina hanno indotto un'inclinazione delle radici simile nelle nostre condizioni di crescita (Figure 2b e 6a). Allo stesso tempo, abbiamo testato derivati dell'acido urmotonico e ne abbiamo selezionato alcuni che, a determinate concentrazioni, inducevano una crescita obliqua delle radici. I composti 8, 9 e 15 hanno modificato la direzione di crescita delle radici rispettivamente a 75 μM, 50 μM e 40 μM, indicando che questi composti possono destabilizzare efficacemente i microtubuli (Fig. 2b, 6a). Abbiamo anche testato il derivato dell'acido ursolico più potente, KAND 11, a una concentrazione inferiore (15 µM) e abbiamo scoperto che l'applicazione di KAND 11 inibiva la crescita delle radici e che la direzione di crescita delle radici era irregolare, sebbene tendessero a inclinarsi verso sinistra (Figura C3). Poiché concentrazioni più elevate di farmaci destabilizzanti i microtubuli a volte inibiscono la crescita delle piante anziché causare l'inclinazione delle radici, abbiamo successivamente valutato la possibilità che KAND 11 influenzi i microtubuli osservando i microtubuli corticali nelle cellule epidermiche delle radici. L'immunoistochimica con anticorpi anti-β-tubulina su cellule epidermiche di radici di plantule trattate con 25 μM di KAND 11 ha mostrato la scomparsa di quasi tutti i microtubuli corticali nelle cellule epidermiche nella zona di allungamento (Fig. 6b). Questi risultati indicano che l'acido kumamotonico e i suoi derivati agiscono direttamente o indirettamente sui microtubuli per interromperli e che questi composti sono nuovi inibitori dei microtubuli.
L'acido ursonico e i suoi derivati alterano i microtubuli corticali in Arabidopsis thaliana. (a) Angolo di inclinazione della radice misurato in presenza di vari derivati dell'acido urmotonico alle concentrazioni indicate. Sono stati analizzati anche gli effetti di due composti noti per inibire i microtubuli: disopiramide e orizalina. L'inserto mostra lo standard utilizzato per misurare l'angolo di crescita della radice. Gli asterischi indicano differenze significative con il trattamento fittizio (test t, p< 0,05). n>19. Barra di scala = 1 cm. (b) Microtubuli corticali nelle cellule epidermiche nella zona di allungamento. I microtubuli nelle radici di Arabidopsis Col di tipo selvatico cresciute su piastre MS con o senza 25 μM di KAND 11 sono stati visualizzati mediante colorazione immunoistochimica utilizzando anticorpi primari anti-β-tubulina e anticorpi secondari coniugati con Alexa Fluor. Barra di scala = 10 µm. (c) Struttura mitotica dei microtubuli nel meristema radicale. I microtubuli sono stati visualizzati mediante colorazione immunoistochimica. Le strutture mitotiche, comprese le zone profase, i fusi e i fragmoplasti, sono state contate da immagini confocali. Le frecce indicano le strutture mitotiche dei microtubuli. Gli asterischi indicano differenze significative con il trattamento fittizio (test t, p< 0,05). n>9. Scala grafica = 50 µm.
Sebbene Ursa abbia la capacità di interrompere la funzione dei microtubuli, si prevede che il suo meccanismo d'azione sia diverso da quello dei tipici agenti depolimerizzanti dei microtubuli. Ad esempio, concentrazioni più elevate di agenti depolimerizzanti dei microtubuli come la disopiramide e l'orizalina inducono un'espansione anisotropa delle cellule epidermiche, mentre KAND 11 non lo fa. Inoltre, la co-applicazione di KAND 11 e disopiramide ha determinato una risposta combinata di crescita delle radici indotta dalla disopiramide e si è osservata un'inibizione della crescita indotta da KAND 11 (Fig. S4). Abbiamo anche analizzato la risposta del mutante ipersensibile disopiramide 1-1 (phs1-1) a KAND 11. phs1-1 presenta una mutazione puntiforme non canonica della tubulina chinasi e produce radici più corte se trattato con disopiramide9,20. Le piantine mutanti phs1-1 cresciute su terreno agarizzato contenente KAND 11 avevano radici più corte, simili a quelle cresciute su disopiramide (fig. S5).
Inoltre, abbiamo osservato strutture di microtubuli mitotici, come zone di profase, fusi e fragmoplasti, nel meristema radicale delle plantule trattate con KAND 11. In linea con le osservazioni per CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS, è stata osservata una significativa diminuzione del numero di microtubuli mitotici (Fig. 6c).
Per caratterizzare la citotossicità di KAND 11 a risoluzione subcellulare, abbiamo trattato cellule in sospensione di tabacco BY-2 con KAND 11 e ne abbiamo osservato la risposta. Abbiamo prima aggiunto KAND 11 a cellule BY-2 che esprimono TagRFP-TUA6, che etichetta fluorescentemente i microtubuli, per valutare l'effetto di KAND 11 sui microtubuli corticali. La densità dei microtubuli corticali è stata valutata mediante analisi di immagine, che ha quantificato la percentuale di pixel citoscheletrici tra i pixel citoplasmatici. I risultati del test hanno mostrato che dopo il trattamento con 50 μM o 100 μM di KAND 11 per 1 ora, la densità è diminuita significativamente rispettivamente allo 0,94 ± 0,74% o allo 0,23 ± 0,28%, mentre la densità delle cellule trattate con DMSO ammontava all'1,61 ± 0,34% (Fig. 7a). Questi risultati sono coerenti con l'osservazione in Arabidopsis che il trattamento con KAND 11 induce la depolimerizzazione dei microtubuli corticali (Fig. 6b). Abbiamo anche esaminato la linea BY-2 con filamenti di actina marcati con GFP-ABD dopo il trattamento con la stessa concentrazione di KAND 11 e abbiamo osservato che il trattamento con KAND 11 ha interrotto i filamenti di actina. Il trattamento con 50 μM o 100 μM di KAND 11 per 1 ora ha ridotto significativamente la densità dei filamenti di actina rispettivamente all'1,20 ± 0,62% o allo 0,61 ± 0,26%, mentre la densità nelle cellule trattate con DMSO era dell'1,69 ± 0,51% (Fig. 2). 7b). Questi risultati contrastano con gli effetti della propizamide, che non influenza i filamenti di actina, e della latrunculina B, un depolimerizzante dell'actina che non influenza i microtubuli (Figura S6 SI). Inoltre, il trattamento con coumamonamide 1, acido coumamonamide 6 o KAND 11 non ha influenzato i microtubuli nelle cellule HeLa (Figura S7 SI). Pertanto, si ritiene che il meccanismo d'azione di KAND 11 sia diverso da quello dei noti distruttori del citoscheletro. Inoltre, la nostra osservazione microscopica delle cellule BY-2 trattate con KAND 11 ha rivelato l'inizio della morte cellulare durante il trattamento con KAND 11 e ha mostrato che la percentuale di cellule morte colorate con blu di Evans non è aumentata significativamente dopo 30 minuti di trattamento con KAND 11, mentre dopo 90 minuti di trattamento con 50 μM o 100 μM di KAND, il numero di cellule morte è aumentato rispettivamente al 43,7% o all'80,1% (Fig. 7c). Nel complesso, questi dati indicano che il nuovo derivato dell'acido ursolico KAND 11 è un inibitore del citoscheletro specifico per le piante con un meccanismo d'azione precedentemente sconosciuto.
KAND influenza i microtubuli corticali, i filamenti di actina e la vitalità delle cellule di tabacco BY-2. (a) Visualizzazione dei microtubuli corticali nelle cellule BY-2 in presenza di TagRFP-TUA6. Le cellule BY-2 trattate con KAND 11 (50 μM o 100 μM) o DMSO sono state esaminate mediante microscopia confocale. La densità dei microtubuli corticali è stata calcolata da micrografie di 25 cellule indipendenti. Le lettere indicano differenze significative (test HSD di Tukey, p< 0,05). Barra di scala = 10 µm. (b) Filamenti di actina corticale nelle cellule BY-2 visualizzati in presenza di GFP-ABD2. Le cellule BY-2 trattate con KAND 11 (50 μM o 100 μM) o DMSO sono state esaminate mediante microscopia confocale. La densità dei filamenti di actina corticale è stata calcolata da micrografie di 25 cellule indipendenti. Le lettere indicano differenze significative (test HSD di Tukey, p< 0,05). Barra di scala = 10 µm. (c) Osservazione di cellule BY-2 morte mediante colorazione con blu di Evans. Le cellule BY-2 trattate con KAND 11 (50 μM o 100 μM) o DMSO sono state esaminate mediante microscopia in campo chiaro. n=3. Barra di scala = 100 µm.
La scoperta e l'applicazione di nuovi prodotti naturali hanno portato a significativi progressi in vari aspetti della vita umana, tra cui la medicina e l'agricoltura. La ricerca storica si è concentrata sull'ottenimento di composti utili da risorse naturali. In particolare, gli attinomiceti sono noti per la loro utilità come antibiotici antiparassitari contro i nematodi, grazie alla loro capacità di produrre diversi metaboliti secondari come l'avermectina, il composto principale dell'ivermectina e della bleomicina e dei suoi derivati, utilizzati in medicina come agenti antitumorali21,22. Allo stesso modo, dagli attinomiceti sono stati scoperti diversi composti erbicidi, alcuni dei quali sono già utilizzati commercialmente1,23. Pertanto, l'analisi dei metaboliti degli attinomiceti per isolare prodotti naturali con le attività biologiche desiderate è considerata una strategia efficace. In questo studio, abbiamo scoperto un nuovo composto, la coumamonamide, da S. werraensis e lo abbiamo sintetizzato con successo. L'acido ursonico è un intermedio di sintesi dell'urbenamide e dei suoi derivati. Può causare il caratteristico arricciamento delle radici, esibire un'attività erbicida da moderata a forte e danneggiare direttamente o indirettamente i microtubuli delle piante. Tuttavia, il meccanismo d'azione dell'acido urmotonico potrebbe differire da quello degli inibitori dei microtubuli esistenti, poiché KAND 11 interrompe anche i filamenti di actina e causa la morte cellulare, suggerendo un meccanismo regolatorio attraverso il quale l'acido urmotonico e i suoi derivati influenzano un'ampia gamma di strutture citoscheletriche.
Un'ulteriore caratterizzazione dettagliata dell'acido urbenonico contribuirà a una migliore comprensione del suo meccanismo d'azione. In particolare, il prossimo obiettivo è valutare la capacità dell'acido urbenonico di legarsi ai microtubuli ridotti per determinare se l'acido urbenonico e i suoi derivati agiscano direttamente sui microtubuli depolimerizzandoli, o se la loro azione provochi la destabilizzazione dei microtubuli stessi. Inoltre, nel caso in cui i microtubuli non siano un bersaglio diretto, l'identificazione del sito d'azione e dei bersagli molecolari dell'acido urbenonico sulle cellule vegetali contribuirà a una migliore comprensione delle proprietà dei composti correlati e delle possibili modalità per migliorarne l'attività erbicida. Il nostro test di bioattività ha rivelato l'esclusiva capacità citotossica dell'acido urbenonico sulla crescita di piante come Arabidopsis thaliana, tabacco ed epatiche, mentre le cellule di E. coli e HeLa non sono state influenzate. La scarsa o nulla tossicità per le cellule animali rappresenta un vantaggio per i derivati dell'acido urbenonico qualora vengano sviluppati come erbicidi per l'uso in campo aperto. Infatti, poiché i microtubuli sono strutture comuni negli eucarioti, la loro inibizione selettiva nelle piante è un requisito fondamentale per gli erbicidi. Ad esempio, la propizamide, un agente depolimerizzante dei microtubuli che si lega direttamente alla tubulina e ne inibisce la polimerizzazione, è utilizzata come erbicida grazie alla sua bassa tossicità per le cellule animali24. A differenza della disopiramide, le benzamidi correlate presentano specificità di bersaglio diverse. Oltre ai microtubuli vegetali, RH-4032 o benzoxamide inibiscono rispettivamente anche i microtubuli delle cellule animali o degli oomiceti, e la zalilamide è utilizzata come fungicida grazie alla sua bassa fitotossicità25,26,27. Il composto recentemente scoperto, il bear, e i suoi derivati mostrano citotossicità selettiva nei confronti delle piante, ma è importante notare che ulteriori modifiche potrebbero alterarne la specificità di bersaglio, fornendo potenzialmente ulteriori derivati per il controllo di funghi patogeni o oomiceti.
Le proprietà uniche dell'acido urbenonico e dei suoi derivati sono utili per il loro sviluppo come erbicidi e per il loro utilizzo come strumenti di ricerca. L'importanza del citoscheletro nel controllo della forma delle cellule vegetali è ampiamente riconosciuta. Studi precedenti hanno dimostrato che le piante hanno sviluppato complessi meccanismi di organizzazione dei microtubuli corticali controllandone la dinamica per regolare correttamente la morfogenesi. Sono state identificate numerose molecole responsabili della regolazione dell'attività dei microtubuli e la ricerca in questo campo è tuttora in corso3,4,28. La nostra attuale comprensione della dinamica dei microtubuli nelle cellule vegetali non spiega completamente i meccanismi di organizzazione dei microtubuli corticali. Ad esempio, sebbene sia la disopiramide che l'orizalina possano depolimerizzare i microtubuli, la disopiramide causa una grave distorsione delle radici, mentre l'orizalina ha un effetto relativamente lieve. Inoltre, le mutazioni nella tubulina, che stabilizza i microtubuli, causano anche destrorotazione nelle radici, mentre il paclitaxel, che stabilizza anch'esso la dinamica dei microtubuli, non la provoca. Pertanto, lo studio e l'identificazione dei bersagli molecolari dell'acido ursolico dovrebbero fornire nuove informazioni sulla regolazione dei microtubuli corticali delle piante. Allo stesso modo, futuri confronti tra sostanze chimiche efficaci nel promuovere una crescita anomala, come la disopiramide, e sostanze meno efficaci, come l'orizalina o l'acido kumamotorio, forniranno indizi su come si verifica tale crescita.
D'altra parte, i riarrangiamenti del citoscheletro correlati alla difesa rappresentano un'altra possibile spiegazione della citotossicità dell'acido ursonico. L'infezione da un patogeno o l'introduzione di un elicitor nelle cellule vegetali a volte causa la distruzione del citoscheletro e la conseguente morte cellulare29. Ad esempio, è stato riportato che la criptoxantina derivata dagli oomiceti interrompe i microtubuli e i filamenti di actina prima della morte delle cellule di tabacco, in modo simile a quanto accade con il trattamento KAND30,31. Le somiglianze tra le risposte di difesa e le risposte cellulari indotte dall'acido ursonico ci hanno portato a ipotizzare che esse inneschino processi cellulari comuni, sebbene sia evidente un effetto più rapido e più forte dell'acido ursonico rispetto alla criptoxantina. Tuttavia, studi hanno dimostrato che l'interruzione dei filamenti di actina promuove la morte cellulare spontanea, che non è sempre accompagnata dall'interruzione dei microtubuli29. Inoltre, resta da vedere se il patogeno o l'elicitor causino una crescita radicale distorta, come fanno i derivati dell'acido ursonico. Pertanto, la conoscenza molecolare che collega le risposte difensive al citoscheletro rappresenta un problema interessante da affrontare. Sfruttando la presenza di composti a basso peso molecolare correlati all'acido ursonico, nonché una gamma di derivati con diverse potenze, si potrebbero ottenere opportunità per colpire meccanismi cellulari sconosciuti.
Nel loro insieme, la scoperta e l'applicazione di nuovi composti che modulano la dinamica dei microtubuli forniranno potenti strumenti per affrontare i complessi meccanismi molecolari alla base della determinazione della forma delle cellule vegetali. In questo contesto, l'acido urmotonico, un composto recentemente sviluppato che agisce sui microtubuli e sui filamenti di actina e induce la morte cellulare, potrebbe offrire l'opportunità di decifrare la connessione tra il controllo dei microtubuli e questi altri meccanismi. Pertanto, l'analisi chimica e biologica mediante l'acido urbenonico ci aiuterà a comprendere i meccanismi di regolazione molecolare che controllano il citoscheletro vegetale.
Inoculare S. werraensis MK493-CF1 in una beuta Erlenmeyer da 500 mL con deflettori contenente 110 mL di terreno di coltura iniziale costituito da galattosio al 2% (p/v), pasta Essence al 2% (p/v), Bacto composition -soyton all'1% (p/v) (Thermo Fisher Scientific, Inc.), estratto di mais allo 0,5% (p/v) (KOGOSTCH Co., Ltd., Giappone), (NH4)2SO4 allo 0,2% (p/v) e CaCO3 allo 0,2% in acqua deionizzata (pH 7,4 prima della sterilizzazione). Le colture iniziali sono state incubate su uno shaker rotante (180 rpm) a 27 °C per 2 giorni. Coltivazione di produzione tramite fermentazione allo stato solido. La coltura di inoculo (7 ml) è stata trasferita in una fiasca K-1 da 500 ml contenente 40 g di terreno di produzione costituito da 15 g di orzo pressato (MUSO Co., Ltd., Giappone) e 25 g di acqua deionizzata (pH non regolato prima della sterilizzazione). La fermentazione è stata condotta a 30 °C al buio per 14 giorni. Il materiale di fermentazione è stato estratto con 40 ml/bottiglia di EtOH e centrifugato (1500 g, 4 °C, 10 min). Il surnatante della coltura (60 ml) è stato estratto con una miscela di MeOH/EtOAc al 10%. Lo strato organico è stato evaporato sotto pressione ridotta per ottenere un residuo (59,5 mg), che è stato sottoposto a HPLC con eluizione a gradiente (0–10 minuti: 90%) su una colonna a fase inversa (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 μm, ID 10 mm × lunghezza 250 mm) H2O/CH3CN, 10–35 minuti: 90% H2O/CH3CN a 70% H2O/CH3CN (gradiente), 35–45 minuti: 90% H2O/EtOH, 45–155 minuti: 90% H2O/EtOH a 100% EtOH (gradiente (gradiente), 155–200 min: 100% EtOH) a una velocità di flusso di 1,5 ml/min, la coumamonamide (1, 36,0 mg) è stata isolata come polvere amorfa bianca.
Kumamotoamide(1); 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6,93 (t, J = 2,5 Hz, 1H), 6,76 (dd, J = 4,3, 1,8 Hz 1H), 6,05 (t , J = 3,8 Hz, 1H). ), 4,08 (s, 3H); 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) δ 161,1, 121,0, 119,9, 112,2, 105,0, 68,3; ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ valore calcolato: 141.0659, valore misurato: 141.0663, IR νmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 1537 cm–1.
I semi di Arabidopsis Columbia (Col-0) sono stati ottenuti dall'Arabidopsis Biological Resource Center (ABRC) con autorizzazione per uso di ricerca. I semi di Col-0 sono stati propagati e mantenuti nelle nostre condizioni di laboratorio e utilizzati come piante di Arabidopsis di tipo selvatico. I semi di Arabidopsis sono stati sterilizzati superficialmente e coltivati in terreno di Murashige e Skoog a metà concentrazione contenente 2% di saccarosio (Fujifilm Wako Pure Chemical), 0,05% (p/v) di acido 2-(4-morfolino)etansolfonico (MES) (Fujifilm Wako Pure Chemical) e 1,5% di agar (Fujifilm Wako Pure Chemical), pH 5,7, a 23 °C e luce costante. I semi del mutante phs1-1 sono stati forniti da T. Hashimoto (Nara Institute of Science and Technology).
I semi del ceppo SR-1 sono stati forniti da T. Hashimoto (Nara Institute of Science and Technology) e utilizzati come piante di tabacco selvatiche. I semi di tabacco sono stati sterilizzati superficialmente e immersi in acqua sterile per tre notti per favorire la germinazione, quindi posti in una soluzione a metà concentrazione contenente saccarosio al 2%, MES allo 0,05% (p/v) e gomma di gellano allo 0,8% (Fujifilm Wako Pure Chemical) Murashige. (terreno di coltura di Skoog) con pH 5,7 e incubati a 23°C in condizioni di luce costante.
Il ceppo Tak-1 è stato fornito da T. Kohchi (Università di Kyoto) ed è stato utilizzato come unità sperimentale standard per lo studio sulle epatiche. Il gemma è stato ottenuto da piante coltivate sterilizzate e successivamente piastrato su terreno Gamborg B5 (Fujifilm Wako Pure Chemical) contenente l'1% di saccarosio e lo 0,3% di gomma di gellano e incubato a 23 °C in condizioni di luce continua.
Le cellule di tabacco BY-2 (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2) sono state fornite da S. Hasezawa (Università di Tokyo). Le cellule BY-2 sono state diluite 95 volte in terreno di coltura modificato di Linsmeier e Skoog e integrate settimanalmente con acido 2,4-diclorofenossiacetico 32. La sospensione cellulare è stata miscelata su uno shaker rotante a 130 rpm a 27°C al buio. Lavare le cellule con un volume di terreno fresco pari a 10 volte il loro peso e risospenderle nello stesso terreno. Linee cellulari transgeniche BY-2 che esprimono stabilmente il marcatore dei microtubuli TagRFP-TUA6 o il marcatore dei filamenti di actina GFP-ABD2 sotto il promotore 35S del virus del mosaico del cavolfiore sono state generate come descritto33,34,35. Queste linee cellulari possono essere mantenute e sincronizzate utilizzando procedure simili a quelle utilizzate per la linea cellulare BY-2 originale.
Le cellule HeLa sono state coltivate in terreno di coltura Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) (Life Technologies) supplementato con il 10% di siero fetale bovino, 1,2 U/ml di penicillina e 1,2 μg/ml di streptomicina in un incubatore a 37 °C con il 5% di CO2.
Tutti gli esperimenti descritti in questo manoscritto sono stati condotti in conformità con le normative e le linee guida giapponesi in materia di biosicurezza.
I composti sono stati disciolti in dimetilsolfossido (DMSO; Fujifilm Wako Pure Chemical) come soluzioni stock e diluiti in terreno MS per Arabidopsis e tabacco o in terreno Gamborg B5 per epatiche. Per il test di inibizione della crescita radicale, più di 10 semi per piastra sono stati seminati su terreno agarizzato contenente i composti indicati o DMSO. I semi sono stati incubati in una camera di crescita per 7 giorni. Le plantule sono state fotografate e la lunghezza delle radici è stata misurata. Per il test di germinazione di Arabidopsis, 48 semi per piastra sono stati seminati su terreno agarizzato contenente 200 μM di composto o DMSO. I semi di Arabidopsis sono stati coltivati in una camera di crescita e il numero di plantule germinate è stato contato 7 giorni dopo la germinazione (dag). Per il test di germinazione del tabacco, 24 semi per piastra sono stati seminati su terreno agarizzato contenente 200 μM di KAND o DMSO. I semi di tabacco sono stati coltivati in una camera di crescita e il numero di piantine germinate è stato contato dopo 14 giorni. Per il test di inibizione della crescita delle epatiche, 9 embrioni da ciascuna piastra sono stati seminati su un terreno di coltura agarizzato contenente le concentrazioni indicate di KAND o DMSO e incubati in una camera di crescita per 14 giorni.
Utilizzare piantine colorate con ioduro di propidio (PI) a una concentrazione di 5 mg/ml per visualizzare l'organizzazione del meristema radicale. I segnali di PI sono stati osservati mediante microscopia a fluorescenza utilizzando un microscopio confocale a scansione laser TCS SPE (Leica Microsystems).
La colorazione istochimica delle radici con β-glucuronidasi (GUS) è stata eseguita secondo il protocollo descritto da Malami e Benfey36. Le piantine sono state fissate in acetone al 90% per una notte, colorate con 0,5 mg/ml di acido 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-d-glucuronico in tampone GUS per 1 ora e poste in una soluzione di cloraldeide idrata (8 g di cloralio idrato, 2 ml di acqua e 1 ml di glicerolo) e osservate mediante microscopia a contrasto di interferenza differenziale utilizzando un microscopio Axio Imager M1 (Carl Zeiss).
L'angolo delle radici è stato misurato su piantine di 7 giorni coltivate su piastre posizionate verticalmente. Misurare l'angolo della radice rispetto alla direzione del vettore gravità come descritto al punto 6.
La disposizione dei microtubuli corticali è stata osservata come descritto, con piccole modifiche al protocollo 37. L'anticorpo anti-β-tubulina (KMX-1, Merk Millipore: MAB3408) e l'anticorpo anti-topo IgG coniugato con Alexa Fluor 488 (Thermo Fisher Scientific: A32723) sono stati utilizzati come anticorpi primario e secondario a diluizioni rispettivamente di 1:1000 e 1:100. Le immagini di fluorescenza sono state acquisite utilizzando un microscopio confocale a scansione laser TCS SPE (Leica Microsystems). Acquisire le immagini Z-stack e creare proiezioni di massima intensità secondo le istruzioni del produttore.
Il test di proliferazione delle cellule HeLa è stato eseguito utilizzando il kit Cell Counting Kit 8 (Dojindo) secondo le istruzioni del produttore.
La crescita di E. coli DH5α è stata analizzata misurando la densità cellulare in coltura mediante uno spettrofotometro a 600 nm (OD600).
L'organizzazione del citoscheletro nelle cellule transgeniche BY-2 è stata osservata utilizzando un microscopio a fluorescenza dotato di un dispositivo di scansione confocale CSU-X1 (Yokogawa) e di una telecamera sCMOS (Zyla, Andor Technology). La densità del citoscheletro è stata valutata mediante analisi delle immagini, che ha quantificato la percentuale di pixel citoscheletrici tra i pixel citoplasmatici nelle immagini confocali utilizzando il software ImageJ come descritto38,39.
Per rilevare la morte cellulare nelle cellule BY-2, un'aliquota della sospensione cellulare è stata incubata con blu di Evans allo 0,05% per 10 minuti a temperatura ambiente. La colorazione selettiva con blu di Evans delle cellule morte dipende dall'estrusione del colorante dalle cellule vitali attraverso la membrana plasmatica intatta40. Le cellule colorate sono state osservate utilizzando un microscopio a campo chiaro (BX53, Olympus).
Le cellule HeLa sono state coltivate in DMEM supplementato con il 10% di FBS in un incubatore umidificato a 37°C e 5% di CO2. Le cellule sono state trattate con 100 μM di KAND 11, acido kumamonamico 6, kumamonamide 1, 100 ng/ml di colcemid (Gibco) o 100 ng/ml di Nocodmaze (Sigma) per 6 ore a 37°C. Le cellule sono state fissate con MetOH per 10 minuti e poi con acetato per 5 minuti a temperatura ambiente. Le cellule fissate sono state incubate con l'anticorpo primario anti-β-tubulina (1D4A4, Proteintech: 66240-1) diluito in BSA/PBS allo 0,5% per 2 ore, lavate 3 volte con TBST e poi incubate con l'anticorpo secondario Alexa Fluor di capra. 488 1 ora. – IgG di topo (Thermo Fisher Scientific: A11001) e 15 ng/ml di 4′,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) diluiti in BSA/PBS allo 0,5%. Dopo tre lavaggi con TBST, le cellule colorate sono state osservate al microscopio invertito Nikon Eclipse Ti-E. Le immagini sono state acquisite con una telecamera CCD raffreddata Hamamatsu ORCA-R2 utilizzando il software MetaMorph (Molecular Devices).
Data di pubblicazione: 17 giugno 2024
