In un precedente progetto che testava gli impianti di trasformazione alimentare locali per la lotta alle zanzare in Thailandia, gli oli essenziali (EO) di Cyperus rotundus, galanga e cannella hanno dimostrato di avere una buona attività antizanzare contro Aedes aegypti. Nel tentativo di ridurre l'uso di prodotti tradizionaliinsetticidie migliorare il controllo delle popolazioni di zanzare resistenti, questo studio mirava a identificare il potenziale sinergismo tra gli effetti adulticidi dell'ossido di etilene e la tossicità della permetrina sulle zanzare Aedes aegypti, compresi i ceppi resistenti e sensibili ai piretroidi.
Valutare la composizione chimica e l'attività letale dell'olio essenziale estratto dai rizomi di C. rotundus e A. galanga e dalla corteccia di C. verum contro il ceppo suscettibile Muang Chiang Mai (MCM-S) e il ceppo resistente Pang Mai Dang (PMD-R). Aedes aegypti adulto attivo. È stato inoltre eseguito un biotest su adulti della miscela EO-permetrina su queste zanzare Aedes per comprenderne l'attività sinergica. ceppi di aedes aegypti.
La caratterizzazione chimica mediante il metodo analitico GC-MS ha mostrato l'identificazione di 48 composti dagli oli essenziali di C. rotundus, A. galanga e C. verum, che rappresentano rispettivamente l'80,22%, l'86,75% e il 97,24% dei componenti totali. Il ciperene (14,04%), il β-bisabolene (18,27%) e la cinnamaldeide (64,66%) sono i principali componenti dell'olio di cipero, dell'olio di galanga e dell'olio balsamico, rispettivamente. Nei test biologici di uccisione degli adulti, gli EV di C. rotundus, A. galanga e C. verum si sono dimostrati efficaci nell'uccisione degli Ae. I valori di LD50 di MCM-S e PMD-R erano rispettivamente di 10,05 e 9,57 μg/mg femmina, 7,97 e 7,94 μg/mg femmina e 3,30 e 3,22 μg/mg femmina. L'efficacia di MCM-S e PMD-R Ae nell'uccidere gli adulti. aegypti in questi oli essenziali era simile a quella del piperonil butossido (valori di PBO, LD50 = 6,30 e 4,79 μg/mg femmina, rispettivamente), ma non così pronunciata come quella della permetrina (valori di LD50 = 0,44 e 3,70 ng/mg femmina rispettivamente). Tuttavia, biotest combinati hanno rilevato una sinergia tra oli essenziali e permetrina. Sinergismo significativo con la permetrina contro due ceppi di zanzare Aedes. Aedes aegypti è stata osservata nell'EM di C. rotundus e A. galanga. L'aggiunta di oli di C. rotundus e A. galanga ha ridotto significativamente i valori di LD50 della permetrina su MCM-S da 0,44 a 0,07 ng/mg e 0,11 ng/mg nelle femmine, rispettivamente, con valori di rapporto di sinergia (SR) di 6,28 e 4,00 rispettivamente. Inoltre, gli oli essenziali di C. rotundus e A. galanga hanno anche ridotto significativamente i valori di LD50 della permetrina su PMD-R da 3,70 a 0,42 ng/mg e 0,003 ng/mg nelle femmine, rispettivamente, con valori di SR di 8,81 e 1233,33.
Effetto sinergico di una combinazione di EO e permetrina per aumentare la tossicità degli adulti contro due ceppi di zanzare Aedes. Aedes aegypti dimostra un ruolo promettente per l'ossido di etilene come sinergico nel migliorare l'efficacia antizanzare, soprattutto quando i composti tradizionali sono inefficaci o inappropriati.
La zanzara Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) è il principale vettore della febbre dengue e di altre malattie virali infettive come la febbre gialla, la chikungunya e il virus Zika, rappresentando una minaccia enorme e persistente per gli esseri umani[1, 2]. Il virus dengue è la febbre emorragica patogena più grave che colpisce gli esseri umani, con una stima di 5-100 milioni di casi che si verificano ogni anno e oltre 2,5 miliardi di persone in tutto il mondo a rischio[3]. Le epidemie di questa malattia infettiva rappresentano un enorme onere per le popolazioni, i sistemi sanitari e le economie della maggior parte dei paesi tropicali[1]. Secondo il Ministero della Salute thailandese, nel 2015 sono stati segnalati 142.925 casi di febbre dengue e 141 decessi a livello nazionale, più di tre volte il numero di casi e decessi nel 2014[4]. Nonostante le prove storiche, la febbre dengue è stata sradicata o notevolmente ridotta dalla zanzara Aedes. A seguito del controllo di Aedes aegypti [5], i tassi di infezione sono aumentati drasticamente e la malattia si è diffusa in tutto il mondo, in parte a causa di decenni di riscaldamento globale. L'eliminazione e il controllo di Ae. Aedes aegypti sono relativamente difficili perché è una zanzara domestica vettore che si accoppia, si nutre, riposa e depone le uova dentro e intorno alle abitazioni umane durante il giorno. Inoltre, questa zanzara ha la capacità di adattarsi ai cambiamenti ambientali o ai disturbi causati da eventi naturali (come la siccità) o alle misure di controllo umane e può tornare ai suoi numeri originali [6, 7]. Poiché i vaccini contro la febbre dengue sono stati approvati solo di recente e non esiste un trattamento specifico per la febbre dengue, prevenire e ridurre il rischio di trasmissione della dengue dipende interamente dal controllo delle zanzare vettori e dall'eliminazione del contatto umano con i vettori.
In particolare, l'uso di prodotti chimici per il controllo delle zanzare svolge oggi un ruolo importante nella salute pubblica come componente fondamentale di una gestione integrata completa dei vettori. I metodi chimici più diffusi includono l'uso di insetticidi a bassa tossicità che agiscono contro le larve di zanzara (larvicidi) e le zanzare adulte (adidocidi). Il controllo delle larve attraverso la riduzione delle fonti e l'uso regolare di larvicidi chimici come organofosfati e regolatori della crescita degli insetti è considerato importante. Tuttavia, gli impatti ambientali negativi associati ai pesticidi sintetici e alla loro manutenzione complessa e ad alta intensità di lavoro rimangono una preoccupazione importante [8, 9]. Il controllo attivo tradizionale dei vettori, come il controllo degli adulti, rimane il mezzo di controllo più efficace durante le epidemie virali perché può eradicare rapidamente e su larga scala i vettori di malattie infettive, nonché ridurre la durata della vita e la longevità delle popolazioni locali di vettori [3]. , 10]. Quattro classi di insetticidi chimici: organoclorurati (chiamati semplicemente DDT), organofosfati, carbammati e piretroidi costituiscono la base dei programmi di controllo dei vettori, con i piretroidi considerati la classe di maggior successo. Sono altamente efficaci contro vari artropodi e hanno una bassa tossicità per i mammiferi. Attualmente, i piretroidi sintetici costituiscono la maggior parte dei pesticidi commerciali, rappresentando circa il 25% del mercato globale dei pesticidi [11, 12]. La permetrina e la deltametrina sono insetticidi piretroidi ad ampio spettro che sono stati utilizzati in tutto il mondo per decenni per controllare una varietà di parassiti di importanza agricola e medica [13, 14]. Negli anni '50, il DDT è stato selezionato come prodotto chimico di scelta per il programma nazionale di controllo delle zanzare per la salute pubblica in Thailandia. A seguito dell'uso diffuso del DDT nelle aree endemiche per la malaria, la Thailandia ne ha gradualmente eliminato l'uso tra il 1995 e il 2000, sostituendolo con due piretroidi: permetrina e deltametrina [15, 16]. Questi insetticidi piretroidi sono stati introdotti all'inizio degli anni '90 per controllare la malaria e la febbre dengue, principalmente attraverso trattamenti con zanzariere e l'uso di nebbie termiche e spray a bassissima tossicità [14, 17]. Tuttavia, hanno perso efficacia a causa della forte resistenza delle zanzare e della mancanza di adesione da parte del pubblico, dovuta alle preoccupazioni per la salute pubblica e l'impatto ambientale delle sostanze chimiche sintetiche. Ciò pone sfide significative al successo dei programmi di controllo dei vettori di minaccia [14, 18, 19]. Per rendere la strategia più efficace, sono necessarie contromisure tempestive e appropriate. Le procedure di gestione raccomandate includono la sostituzione di sostanze naturali, la rotazione di sostanze chimiche di classi diverse, l'aggiunta di sinergizzanti e la miscelazione di sostanze chimiche o l'applicazione simultanea di sostanze chimiche di classi diverse [14, 20, 21]. Pertanto, è urgente trovare e sviluppare un'alternativa e un sinergico che siano ecocompatibili, convenienti ed efficaci; questo studio si propone di rispondere a questa esigenza.
Gli insetticidi di origine naturale, in particolare quelli a base di componenti vegetali, hanno mostrato potenziale nella valutazione delle attuali e future alternative per il controllo delle zanzare [22, 23, 24]. Diversi studi hanno dimostrato che è possibile controllare importanti vettori di zanzare utilizzando prodotti vegetali, in particolare oli essenziali (EO), come killer di adulti. Proprietà adulticide contro alcune importanti specie di zanzare sono state riscontrate in molti oli vegetali come sedano, cumino, zedoaria, anice, pepe pipa, timo, Schinus terebinthifolia, Cymbopogon citratus, Cymbopogon schoenanthus, Cymbopogon giganteus, Chenopodium ambrosioides, Cochlospermum planchonii, Eucalyptus ter eticornis, Eucalyptus citriodora, Cananga odorata e Petroselinum Criscum [25,26,27,28,29,30]. L'ossido di etilene viene ora utilizzato non solo da solo, ma anche in combinazione con sostanze vegetali estratte o pesticidi sintetici esistenti, producendo vari gradi di tossicità. Le combinazioni di insetticidi tradizionali come organofosfati, carbammati e piretroidi con ossido di etilene/estratti vegetali agiscono sinergicamente o antagonisticamente nei loro effetti tossici e hanno dimostrato di essere efficaci contro vettori di malattie e parassiti [31,32,33,34,35]. Tuttavia, la maggior parte degli studi sugli effetti tossici sinergici di combinazioni di fitochimici con o senza sostanze chimiche di sintesi è stata condotta su insetti vettori agricoli e parassiti piuttosto che su zanzare di importanza medica. Inoltre, la maggior parte del lavoro sugli effetti sinergici delle combinazioni di insetticidi vegetali-sintetici contro i vettori delle zanzare si è concentrata sull'effetto larvicida.
In uno studio precedente condotto dagli autori come parte di un progetto di ricerca in corso per lo screening di intimicidi da piante alimentari indigene in Thailandia, è stata riscontrata una potenziale attività degli ossidi di etilene di Cyperus rotundus, galanga e cannella contro le zanzare adulte di Aedes. Egypt [36]. Pertanto, questo studio mirava a valutare l'efficacia degli oli essenziali isolati da queste piante medicinali contro le zanzare Aedes. aegypti, inclusi i ceppi resistenti e sensibili ai piretroidi. È stato inoltre analizzato l'effetto sinergico di miscele binarie di ossido di etilene e piretroidi sintetici con buona efficacia negli adulti per ridurre l'uso di insetticidi tradizionali e aumentare la resistenza ai vettori di zanzare, in particolare contro Aedes. Aedes aegypti. Questo articolo riporta la caratterizzazione chimica di oli essenziali efficaci e il loro potenziale per aumentare la tossicità della permetrina sintetica contro le zanzare Aedes. aegypti nei ceppi sensibili ai piretroidi (MCM-S) e nei ceppi resistenti (PMD-R).
I rizomi di C. rotundus e A. galanga e la corteccia di C. verum (Fig. 1) utilizzati per l'estrazione dell'olio essenziale sono stati acquistati da fornitori di prodotti erboristici nella provincia di Chiang Mai, Thailandia. L'identificazione scientifica di queste piante è stata ottenuta consultando il Sig. James Franklin Maxwell, Botanico dell'Erbario presso il Dipartimento di Biologia, Facoltà di Scienze, Università di Chiang Mai (CMU), Provincia di Chiang Mai, Thailandia, e la scienziata Wannari Charoensap; presso il Dipartimento di Farmacia, Facoltà di Farmacia, Carnegie Mellon University, la Sig.ra Voucher conserva esemplari di ciascuna pianta presso il Dipartimento di Parassitologia della Facoltà di Medicina della Carnegie Mellon University per un utilizzo futuro.
I campioni di piante sono stati essiccati individualmente all'ombra per 3-5 giorni in uno spazio aperto con ventilazione attiva e una temperatura ambiente di circa 30 ± 5 °C per rimuovere l'umidità prima dell'estrazione degli oli essenziali naturali (OE). Un totale di 250 g di ciascun materiale vegetale secco è stato macinato meccanicamente fino a ottenere una polvere grossolana e utilizzato per isolare gli oli essenziali (OE) mediante distillazione a vapore. L'apparato di distillazione era costituito da un mantello riscaldante elettrico, un pallone a fondo tondo da 3000 mL, una colonna di estrazione, un condensatore e un dispositivo Cool Ace (Eyela Cool Ace CA-1112 CE, Tokyo Rikakikai Co. Ltd., Tokyo, Giappone). Aggiungere 1600 ml di acqua distillata e 10-15 microsfere di vetro al pallone e quindi riscaldarlo a circa 100 °C utilizzando un riscaldatore elettrico per almeno 3 ore fino al completamento della distillazione e alla completa produzione di OE. Lo strato di EO è stato separato dalla fase acquosa mediante un imbuto separatore, essiccato su solfato di sodio anidro (Na2SO4) e conservato in una bottiglia marrone sigillata a 4°C fino all'esame della composizione chimica e dell'attività dell'adulto.
La composizione chimica degli oli essenziali è stata determinata contemporaneamente al biotest per la sostanza adulta. L'analisi qualitativa è stata eseguita utilizzando un sistema GC-MS composto da un gascromatografo Hewlett-Packard (Wilmington, CA, USA) 7890A dotato di un rivelatore selettivo di massa a singolo quadrupolo (Agilent Technologies, Wilmington, CA, USA) e un MSD 5975C (EI). (Agilent Technologies).
Colonna cromatografica – DB-5MS (30 m × diametro interno 0,25 mm × spessore del film 0,25 µm). Il tempo totale di analisi GC-MS è stato di 20 minuti. Le condizioni di analisi prevedono che le temperature dell'iniettore e della linea di trasferimento siano rispettivamente di 250 e 280 °C; la temperatura del forno è impostata per aumentare da 50 °C a 250 °C a una velocità di 10 °C/min; il gas di trasporto è l'elio; la portata è di 1,0 ml/min; il volume di iniezione è di 0,2 µL (1/10% in volume in CH2Cl2, rapporto di splittaggio 100:1); Per la rivelazione GC-MS viene utilizzato un sistema a ionizzazione elettronica con un'energia di ionizzazione di 70 eV. L'intervallo di acquisizione è di 50-550 unità di massa atomica (uma) e la velocità di scansione è di 2,91 scansioni al secondo. Le percentuali relative dei componenti sono espresse come percentuali normalizzate per l'area del picco. L'identificazione degli ingredienti EO si basa sul loro indice di ritenzione (RI). L'RI è stato calcolato utilizzando l'equazione di Van den Dool e Kratz [37] per la serie degli n-alcani (C8-C40) e confrontato con gli indici di ritenzione della letteratura [38] e dei database di biblioteche (NIST 2008 e Wiley 8NO8). L'identità dei composti mostrati, come la struttura e la formula molecolare, è stata confermata dal confronto con campioni autentici disponibili.
Gli standard analitici per la permetrina sintetica e il piperonil butossido (PBO, controllo positivo negli studi di sinergia) sono stati acquistati da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). I kit per i test per adulti dell'Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS) e le dosi diagnostiche di carta impregnata di permetrina (0,75%) sono stati acquistati presso il Centro di Controllo dei Vettori dell'OMS a Penang, Malesia. Tutti gli altri prodotti chimici e reagenti utilizzati erano di grado analitico e sono stati acquistati da istituti locali nella provincia di Chiang Mai, Thailandia.
Le zanzare utilizzate come organismi di prova nel biotest sugli adulti erano zanzare Aedes aegypti da laboratorio che si accoppiavano liberamente, incluso il ceppo suscettibile di Muang Chiang Mai (MCM-S) e il ceppo resistente di Pang Mai Dang (PMD-R). Il ceppo MCM-S è stato ottenuto da campioni locali raccolti nell'area di Muang Chiang Mai, provincia di Chiang Mai, Thailandia, ed è stato conservato nella sala di entomologia del Dipartimento di Parassitologia, Facoltà di Medicina della CMU, dal 1995 [39]. Il ceppo PMD-R, che è risultato resistente alla permetrina, è stato isolato da zanzare di campo originariamente raccolte da Ban Pang Mai Dang, distretto di Mae Tang, provincia di Chiang Mai, Thailandia, ed è stato conservato presso lo stesso istituto dal 1997 [40]. I ceppi PMD-R sono stati coltivati sotto pressione selettiva per mantenere i livelli di resistenza mediante esposizione intermittente allo 0,75% di permetrina utilizzando il kit di rilevamento dell'OMS con alcune modifiche [41]. Ogni ceppo di Ae. Aedes aegypti è stata colonizzata individualmente in un laboratorio privo di agenti patogeni a 25 ± 2 °C e 80 ± 10% di umidità relativa e un fotoperiodo luce/buio di 14:10 ore. Circa 200 larve sono state tenute in vassoi di plastica (33 cm di lunghezza, 28 cm di larghezza e 9 cm di altezza) riempiti con acqua di rubinetto a una densità di 150-200 larve per vassoio e alimentati due volte al giorno con biscotti sterilizzati per cani. I vermi adulti sono stati tenuti in gabbie umide e alimentati continuamente con una soluzione acquosa di saccarosio al 10% e una soluzione di sciroppo multivitaminico al 10%. Le zanzare femmine succhiano regolarmente il sangue per deporre le uova. Le femmine di età compresa tra due e cinque giorni che non sono state alimentate con sangue possono essere utilizzate continuamente in test biologici sperimentali sugli adulti.
È stato eseguito un biotest dose-mortalità di EO su femmine adulte di zanzare Aedes aegypti, MCM-S e PMD-R utilizzando un metodo topico modificato secondo il protocollo standard dell'OMS per i test di sensibilità [42]. L'EO di ciascuna pianta è stato diluito serialmente con un solvente adatto (ad esempio etanolo o acetone) per ottenere una serie graduata di 4-6 concentrazioni. Dopo l'anestesia con anidride carbonica (CO2), le zanzare sono state pesate individualmente. Le zanzare anestetizzate sono state quindi mantenute immobili su carta da filtro asciutta su una piastra fredda personalizzata sotto uno stereomicroscopio per prevenire la riattivazione durante la procedura. Per ogni trattamento, 0,1 μl di soluzione di EO sono stati applicati al pronoto superiore della femmina utilizzando un microdispenser portatile Hamilton (700 Series Microliter™, Hamilton Company, Reno, NV, USA). Venticinque femmine sono state trattate con ciascuna concentrazione, con una mortalità che variava dal 10% al 95% per almeno 4 diverse concentrazioni. Le zanzare trattate con solvente sono state utilizzate come controllo. Per prevenire la contaminazione dei campioni di prova, sostituire la carta da filtro con una nuova carta da filtro per ogni OE testato. Le dosi utilizzate in questi biotest sono espresse in microgrammi di OE per milligrammo di peso corporeo di femmina viva. Anche l'attività del PBO adulto è stata valutata in modo simile all'OE, con il PBO utilizzato come controllo positivo in esperimenti sinergici. Le zanzare trattate in tutti i gruppi sono state poste in bicchieri di plastica e hanno ricevuto il 10% di saccarosio più il 10% di sciroppo multivitaminico. Tutti i biotest sono stati eseguiti a 25 ± 2 °C e 80 ± 10% di umidità relativa e ripetuti quattro volte con i controlli. La mortalità durante il periodo di allevamento di 24 ore è stata verificata e confermata dalla mancanza di risposta della zanzara alla stimolazione meccanica e quindi registrata sulla base della media di quattro repliche. I trattamenti sperimentali sono stati ripetuti quattro volte per ciascun campione di prova utilizzando diversi lotti di zanzare. I risultati sono stati riassunti e utilizzati per calcolare la percentuale di mortalità, che è stata impiegata per determinare la dose letale nelle 24 ore mediante analisi probit.
L'effetto anticida sinergico di EO e permetrina è stato valutato utilizzando una procedura di saggio di tossicità locale [42] come precedentemente descritto. Utilizzare acetone o etanolo come solvente per preparare la permetrina alla concentrazione desiderata, nonché una miscela binaria di EO e permetrina (EO-permetrina: permetrina miscelata con EO alla concentrazione LD25). I kit di test (permetrina ed EO-permetrina) sono stati valutati contro i ceppi MCM-S e PMD-R di Ae. Aedes aegypti. A ciascuna delle 25 zanzare femmine sono state somministrate quattro dosi di permetrina per testarne l'efficacia nell'uccisione degli adulti, con ogni trattamento ripetuto quattro volte. Per identificare i candidati sinergici dell'EO, sono state somministrate da 4 a 6 dosi di EO-permetrina a ciascuna delle 25 zanzare femmine, con ogni applicazione ripetuta quattro volte. Il trattamento con PBO-permetrina (permetrina miscelata con concentrazione LD25 di PBO) è servito anche come controllo positivo. Le dosi utilizzate in questi biotest sono espresse in nanogrammi di campione di prova per milligrammo di peso corporeo vivo della femmina. Sono state condotte quattro valutazioni sperimentali per ciascun ceppo di zanzara su lotti allevati individualmente e i dati di mortalità sono stati aggregati e analizzati utilizzando Probit per determinare la dose letale nelle 24 ore.
Il tasso di mortalità è stato aggiustato utilizzando la formula di Abbott [43]. I dati aggiustati sono stati analizzati mediante analisi di regressione Probit utilizzando il programma di statistica computerizzata SPSS (versione 19.0). I valori letali del 25%, 50%, 90%, 95% e 99% (rispettivamente LD25, LD50, LD90, LD95 e LD99) sono stati calcolati utilizzando i corrispondenti intervalli di confidenza al 95% (95% CI). Le misurazioni di significatività e le differenze tra i campioni di test sono state valutate utilizzando il test del chi-quadrato o il test U di Mann-Whitney all'interno di ciascun test biologico. I risultati sono stati considerati statisticamente significativi a P< 0,05. Il coefficiente di resistenza (RR) è stimato al livello LD50 utilizzando la seguente formula [12]:
RR > 1 indica resistenza, mentre RR ≤ 1 indica sensibilità. Il valore del rapporto di sinergia (SR) di ciascun candidato sinergizzante viene calcolato come segue [34, 35, 44]:
Questo fattore divide i risultati in tre categorie: un valore SR di 1±0,05 è considerato senza effetto apparente, un valore SR >1,05 è considerato con effetto sinergico e un valore SR di Un olio liquido giallo chiaro può essere ottenuto mediante distillazione a vapore dei rizomi di C. rotundus e A. galanga e della corteccia di C. verum. Le rese calcolate sul peso secco sono state rispettivamente dello 0,15%, 0,27% (p/p) e 0,54% (v/v) (Tabella 1). Lo studio GC-MS della composizione chimica degli oli di C. rotundus, A. galanga e C. verum ha mostrato la presenza di 19, 17 e 21 composti, che rappresentavano rispettivamente l'80,22%, l'86,75% e il 97,24% di tutti i componenti (Tabella 2). I composti dell'olio di rizoma di C. lucidum sono costituiti principalmente da ciperonene (14,04%), seguito da carralene (9,57%), α-capsellano (7,97%) e α-capsellano (7,53%). Il principale componente chimico dell'olio di rizoma di galanga è il β-bisabolene (18,27%), seguito da α-bergamotene (16,28%), 1,8-cineolo (10,17%) e piperonolo (10,09%). Mentre la cinnamaldeide (64,66%) è stata identificata come il componente principale dell'olio di corteccia di C. verum, l'acetato cinnamico (6,61%), l'α-copaene (5,83%) e la 3-fenilpropionaldeide (4,09%) sono stati considerati ingredienti minori. Le strutture chimiche del ciperne, del β-bisabolene e della cinnamaldeide sono i principali composti rispettivamente di C. rotundus, A. galanga e C. verum, come mostrato nella Figura 2.
I risultati di tre OO hanno valutato l'attività degli adulti contro le zanzare Aedes. Le zanzare Aedes aegypti sono mostrate nella Tabella 3. Tutti gli EO hanno dimostrato di avere effetti letali sulle zanzare Aedes MCM-S a diversi tipi e dosi. Aedes aegypti. L'EO più efficace è C. verum, seguito da A. galanga e C. rotundus con valori di LD50 rispettivamente di 3,30, 7,97 e 10,05 μg/mg nelle femmine MCM-S, leggermente superiori a 3,22 (U = 1), Z = -0,775, P = 0,667), 7,94 (U = 2, Z = 0, P = 1) e 9,57 (U = 0, Z = -1,549, P = 0,333) μg/mg PMD -R nelle donne. Ciò corrisponde al fatto che il PBO ha un effetto leggermente maggiore negli adulti su PMD-R rispetto al ceppo MSM-S, con valori di LD50 rispettivamente di 4,79 e 6,30 μg/mg nelle femmine (U = 0, Z = -2,021, P = 0,057). Si può calcolare che i valori di LD50 di C. verum, A. galanga, C. rotundus e PBO contro PMD-R sono rispettivamente circa 0,98, 0,99, 0,95 e 0,76 volte inferiori a quelli contro MCM-S. Pertanto, ciò indica che la suscettibilità a PBO ed EO è relativamente simile tra i due ceppi di Aedes. Sebbene PMD-R fosse più suscettibile di MCM-S, la sensibilità di Aedes aegypti non era significativa. Al contrario, i due ceppi di Aedes differivano notevolmente nella loro sensibilità alla permetrina aegypti (Tabella 4). Il PMD-R ha dimostrato una significativa resistenza alla permetrina (valore LD50 = 0,44 ng/mg nelle donne) con un valore LD50 più elevato di 3,70 ng/mg nelle donne rispetto al MCM-S (valore LD50 = 0,44 ng/mg nelle donne) (U = 0, Z = -2,309, P = 0,029). Sebbene il PMD-R sia molto meno sensibile alla permetrina rispetto al MCM-S, la sua sensibilità al PBO e agli oli di C. verum, A. galanga e C. rotundus è leggermente superiore a quella del MCM-S.
Come osservato nel biotest della combinazione EO-permetrina su una popolazione adulta, le miscele binarie di permetrina ed EO (LD25) hanno mostrato sinergia (valore SR > 1,05) o nessun effetto (valore SR = 1 ± 0,05). Gli effetti complessi di una miscela EO-permetrina su zanzare albine sperimentali, i ceppi MCM-S e PMD-R di Aedes aegypti, sono mostrati nella Tabella 4 e nella Figura 3. L'aggiunta di olio di C. verum ha ridotto leggermente la LD50 della permetrina contro MCM-S e aumentato leggermente la LD50 contro PMD-R a 0,44-0,42 ng/mg nelle donne e da 3,70 a 3,85 ng/mg nelle donne, rispettivamente. Al contrario, l'aggiunta di oli di C. rotundus e A. galanga ha ridotto significativamente la DL50 della permetrina su MCM-S da 0,44 a 0,07 (U = 0, Z = -2,309, P = 0,029) e a 0,11 (U = 0, Z) = -2,309, P = 0,029) ng/mg nelle donne. Sulla base dei valori di DL50 di MCM-S, i valori di SR della miscela EO-permetrina dopo l'aggiunta di oli di C. rotundus e A. galanga erano rispettivamente 6,28 e 4,00. Di conseguenza, la DL50 della permetrina contro PMD-R è diminuita significativamente da 3,70 a 0,42 (U = 0, Z = -2,309, P = 0,029) e a 0,003 con l'aggiunta di oli di C. rotundus e A. galanga (U = 0, Z = -2,337, P = 0,029) ng/mg femmina. Il valore di SR della permetrina combinata con C. rotundus contro PMD-R era 8,81, mentre il valore di SR della miscela galanga-permetrina era 1233,33. Rispetto a MCM-S, il valore di LD50 del controllo positivo PBO è diminuito da 0,44 a 0,26 ng/mg (femmine) e da 3,70 ng/mg (femmine) a 0,65 ng/mg (U = 0, Z = -2,309, P = 0,029) e PMD-R (U = 0, Z = -2,309, P = 0,029). I valori di SR della miscela PBO-permetrina per i ceppi MCM-S e PMD-R erano rispettivamente 1,69 e 5,69. Questi risultati indicano che gli oli di C. rotundus e A. galanga e il PBO aumentano la tossicità della permetrina in misura maggiore rispetto all'olio di C. verum per i ceppi MCM-S e PMD-R.
Attività adulta (LD50) di EO, PBO, permetrina (PE) e loro combinazioni contro ceppi di zanzare Aedes sensibili ai piretroidi (MCM-S) e resistenti (PMD-R). Aedes aegypti
[45]. I piretroidi sintetici sono utilizzati in tutto il mondo per controllare quasi tutti gli artropodi di importanza agricola e medica. Tuttavia, a causa delle conseguenze dannose dell'uso di insetticidi sintetici, soprattutto in termini di sviluppo e diffusa resistenza delle zanzare, nonché dell'impatto a lungo termine sulla salute e sull'ambiente, ora vi è un'urgente necessità di ridurre l'uso degli insetticidi sintetici tradizionali e sviluppare alternative [35, 46, 47]. Oltre a proteggere l'ambiente e la salute umana, i vantaggi degli insetticidi botanici includono elevata selettività, disponibilità globale e facilità di produzione e utilizzo, rendendoli più interessanti per il controllo delle zanzare [32,48, 49]. Questo studio, oltre a chiarire le caratteristiche chimiche degli oli essenziali efficaci attraverso l'analisi GC-MS, ha anche valutato la potenza degli oli essenziali adulti e la loro capacità di aumentare la tossicità della permetrina aegypti sintetica nei ceppi sensibili ai piretroidi (MCM-S) e nei ceppi resistenti (PMD-R).
La caratterizzazione GC-MS ha mostrato che il ciperne (14,04%), il β-bisabolene (18,27%) e la cinnamaldeide (64,66%) erano i componenti principali degli oli di C. rotundus, A. galanga e C. verum, rispettivamente. Queste sostanze chimiche hanno dimostrato diverse attività biologiche. Ahn et al. [50] hanno riportato che il 6-acetoxycyperene, isolato dal rizoma di C. rotundus, agisce come un composto antitumorale e può indurre l'apoptosi dipendente dalla caspasi nelle cellule del cancro ovarico. Il β-bisabolene, estratto dall'olio essenziale dell'albero di mirra, mostra una citotossicità specifica contro le cellule tumorali mammarie umane e di topo sia in vitro che in vivo [51]. È stato riportato che la cinnamaldeide, ottenuta da estratti naturali o sintetizzata in laboratorio, ha attività insetticida, antibatterica, antimicotica, antinfiammatoria, immunomodulatrice, antitumorale e antiangiogenica [52].
I risultati del biotest di attività adulto dose-dipendente hanno mostrato un buon potenziale degli EO testati e hanno dimostrato che i ceppi di zanzara Aedes MCM-S e PMD-R avevano una suscettibilità simile a EO e PBO. Aedes aegypti. Un confronto dell'efficacia di EO e permetrina ha mostrato che quest'ultima ha un effetto allercida più forte: i valori di LD50 sono 0,44 e 3,70 ng/mg nelle femmine per i ceppi MCM-S e PMD-R, rispettivamente. Questi risultati sono supportati da molti studi che dimostrano che i pesticidi naturali, in particolare i prodotti di origine vegetale, sono generalmente meno efficaci delle sostanze sintetiche [31, 34, 35, 53, 54]. Ciò potrebbe essere dovuto al fatto che i primi sono una combinazione complessa di ingredienti attivi o inattivi, mentre i secondi sono un singolo composto attivo purificato. Tuttavia, la diversità e la complessità dei principi attivi naturali con diversi meccanismi d'azione possono aumentare l'attività biologica o ostacolare lo sviluppo di resistenza nelle popolazioni ospiti [55, 56, 57]. Molti ricercatori hanno segnalato il potenziale antizanzare di C. verum, A. galanga e C. rotundus e dei loro componenti come β-bisabolene, cinnamaldeide e 1,8-cineolo [22, 36, 58, 59, 60,61, 62,63,64]. Tuttavia, una revisione della letteratura ha rivelato che non ci sono state precedenti segnalazioni del suo effetto sinergico con permetrina o altri insetticidi sintetici contro le zanzare Aedes. Aedes aegypti.
In questo studio, sono state osservate differenze significative nella suscettibilità alla permetrina tra i due ceppi di Aedes. Aedes aegypti. MCM-S è sensibile alla permetrina, mentre PMD-R è molto meno sensibile ad essa, con un tasso di resistenza dell'8,41. Rispetto alla sensibilità di MCM-S, PMD-R è meno sensibile alla permetrina ma più sensibile all'EO, fornendo la base per ulteriori studi volti ad aumentare l'efficacia della permetrina combinandola con EO. Un biotest basato su una combinazione sinergica per gli effetti sugli adulti ha mostrato che miscele binarie di EO e permetrina hanno ridotto o aumentato la mortalità di Aedes adulti. Aedes aegypti. L'aggiunta di olio di C. verum ha leggermente ridotto la LD50 della permetrina contro MCM-S ma ha leggermente aumentato la LD50 contro PMD-R con valori di SR rispettivamente di 1,05 e 0,96. Ciò indica che l'olio di C. verum non ha un effetto sinergico o antagonista sulla permetrina quando testato su MCM-S e PMD-R. Al contrario, gli oli di C. rotundus e A. galanga hanno mostrato un significativo effetto sinergico riducendo significativamente i valori di LD50 della permetrina su MCM-S o PMD-R. Quando la permetrina è stata combinata con EO di C. rotundus e A. galanga, i valori di SR della miscela EO-permetrina per MCM-S erano rispettivamente di 6,28 e 4,00. Inoltre, quando la permetrina è stata valutata contro PMD-R in combinazione con C. rotundus (SR = 8,81) o A. galanga (SR = 1233,33), i valori di SR sono aumentati significativamente. È interessante notare che sia C. rotundus che A. galanga hanno aumentato significativamente la tossicità della permetrina contro PMD-R Ae. aegypti. Analogamente, è stato riscontrato che il PBO aumenta la tossicità della permetrina, con valori di SR di 1,69 e 5,69 rispettivamente per i ceppi MCM-S e PMD-R. Poiché C. rotundus e A. galanga presentavano i valori di SR più elevati, sono stati considerati i migliori sinergici nell'aumentare la tossicità della permetrina su MCM-S e PMD-R, rispettivamente.
Diversi studi precedenti hanno riportato l'effetto sinergico di combinazioni di insetticidi sintetici ed estratti vegetali contro varie specie di zanzare. Un biotest larvicida contro Anopheles Stephensi studiato da Kalayanasundaram e Das [65] ha mostrato che il fenthion, un organofosfato ad ampio spettro, era associato a Cleodendron inerme, Pedalium murax e Parthenium hysterophorus. È stata osservata una sinergia significativa tra gli estratti con un effetto sinergico (SF) rispettivamente di 1,31, 1,38, 1,40, 1,48, 1,61 e 2,23. In uno screening larvicida di 15 specie di mangrovie, l'estratto di etere di petrolio delle radici palafitte di mangrovie si è rivelato più efficace contro Culex quinquefasciatus con un valore LC50 di 25,7 mg/L [66]. È stato inoltre riportato che l'effetto sinergico di questo estratto e dell'insetticida botanico piretro riduce la LC50 del piretro contro le larve di C. quinquefasciatus da 0,132 mg/L a 0,107 mg/L; inoltre, in questo studio è stato utilizzato un calcolo SF di 1,23. 34,35,44]. È stata valutata l'efficacia combinata dell'estratto di radice di cedro Solanum e di diversi insetticidi sintetici (ad esempio, fenthion, cipermetrina (un piretroide sintetico) e timethphos (un larvicida organofosforico)) contro le zanzare Anopheles. Stephensi [54] e C. quinquefasciatus [34]. L'uso combinato di cipermetrina ed estratto di etere di petrolio del frutto giallo ha mostrato un effetto sinergico sulla cipermetrina in tutti i rapporti. Il rapporto più efficace è stata la combinazione binaria 1:1 con valori LC50 e SF rispettivamente di 0,0054 ppm e 6,83, rispetto ad An. Stephen West[54]. Mentre una miscela binaria 1:1 di S. xanthocarpum e temephos era antagonista (SF = 0,6406), la combinazione S. xanthocarpum-fenthion (1:1) ha mostrato attività sinergica contro C. quinquefasciatus con un SF di 1,3125 [34]]. Tong e Blomquist [35] hanno studiato gli effetti dell'ossido di etilene vegetale sulla tossicità del carbaryl (un carbammato ad ampio spettro) e della permetrina per le zanzare Aedes. Aedes aegypti. I risultati hanno mostrato che l'ossido di etilene da agar, pepe nero, ginepro, elicriso, sandalo e sesamo ha aumentato la tossicità del carbaryl per le zanzare Aedes. I valori di SR delle larve di Aedes aegypti variano da 1,0 a 7,0. Al contrario, nessuno degli oli essenziali è risultato tossico per le zanzare adulte di Aedes. Allo stato attuale, non sono stati segnalati effetti sinergici per la combinazione di Aedes aegypti ed EO-carbarile. Il PBO è stato utilizzato come controllo positivo per aumentare la tossicità del carbarile contro le zanzare Aedes. I valori di SR delle larve e degli adulti di Aedes aegypti sono rispettivamente 4,9-9,5 e 2,3. Solo miscele binarie di permetrina ed EO o PBO sono state testate per l'attività larvicida. La miscela EO-permetrina ha avuto un effetto antagonista, mentre la miscela PBO-permetrina ha avuto un effetto sinergico contro le zanzare Aedes. Larve di Aedes aegypti. Tuttavia, non sono ancora stati eseguiti esperimenti di dose-risposta e valutazione del SR per le miscele PBO-permetrina. Sebbene siano stati ottenuti pochi risultati riguardo agli effetti sinergici delle combinazioni fitosintetiche contro le zanzare vettori, questi dati supportano i risultati esistenti, che aprono la prospettiva di aggiungere sinergici non solo per ridurre la dose applicata, ma anche per aumentarne l'effetto letale. Efficienza degli insetti. Inoltre, i risultati di questo studio hanno dimostrato per la prima volta che gli oli di C. rotundus e A. galanga esercitano sinergicamente un'efficacia significativamente maggiore contro i ceppi di zanzare Aedes sensibili e resistenti ai piretroidi rispetto al PBO quando combinato con la tossicità della permetrina. Aedes aegypti. Tuttavia, risultati inaspettati dall'analisi sinergica hanno mostrato che l'olio di C. verum ha avuto la maggiore attività anti-adulta contro entrambi i ceppi di Aedes. Sorprendentemente, l'effetto tossico della permetrina su Aedes aegypti è stato insoddisfacente. Le variazioni negli effetti tossici e negli effetti sinergici possono essere dovute in parte all'esposizione a diversi tipi e livelli di componenti bioattivi in questi oli.
Nonostante gli sforzi per comprendere come migliorare l'efficienza, i meccanismi sinergici rimangono poco chiari. Possibili ragioni della diversa efficacia e del potenziale sinergico possono includere differenze nella composizione chimica dei prodotti testati e differenze nella suscettibilità delle zanzare associate allo stato di resistenza e allo sviluppo. Ci sono differenze tra i componenti principali e minori dell'ossido di etilene testati in questo studio, e alcuni di questi composti hanno dimostrato di avere effetti repellenti e tossici contro una varietà di parassiti e vettori di malattie [61,62,64,67,68]. Tuttavia, i principali composti caratterizzati negli oli di C. rotundus, A. galanga e C. verum, come ciperno, β-bisabolene e cinnamaldeide, non sono stati testati in questo articolo per le loro attività anti-adulto e sinergiche contro Ae, rispettivamente. Aedes aegypti. Pertanto, sono necessari studi futuri per isolare i principi attivi presenti in ciascun olio essenziale e chiarire la loro efficacia insetticida e le interazioni sinergiche contro questo vettore zanzara. In generale, l'attività insetticida dipende dall'azione e dalla reazione tra veleni e tessuti degli insetti, che possono essere semplificate e suddivise in tre fasi: penetrazione nella pelle del corpo dell'insetto e nelle membrane degli organi bersaglio, attivazione (= interazione con il bersaglio) e detossificazione delle sostanze tossiche [57, 69]. Pertanto, il sinergismo insetticida che si traduce in una maggiore efficacia delle combinazioni di sostanze tossiche richiede almeno una di queste categorie, come una maggiore penetrazione, una maggiore attivazione dei composti accumulati o una minore riduzione della detossificazione del principio attivo del pesticida. Ad esempio, la tolleranza energetica ritarda la penetrazione della cuticola attraverso una cuticola ispessita e la resistenza biochimica, come il metabolismo insetticida migliorato osservato in alcuni ceppi di insetti resistenti [70, 71]. La significativa efficacia degli EO nell'aumentare la tossicità della permetrina, in particolare contro il PMD-R, può indicare una soluzione al problema della resistenza agli insetticidi interagendo con i meccanismi di resistenza [57, 69, 70, 71]. Tong e Blomquist [35] hanno supportato i risultati di questo studio dimostrando un'interazione sinergica tra oli essenziali e pesticidi sintetici. aegypti, vi è evidenza di attività inibitoria contro gli enzimi detossificanti, comprese le monoossigenasi del citocromo P450 e le carbossilesterasi, che sono strettamente associate allo sviluppo di resistenza ai pesticidi tradizionali. Il PBO non solo è considerato un inibitore metabolico della monoossigenasi del citocromo P450, ma migliora anche la penetrazione degli insetticidi, come dimostrato dal suo utilizzo come controllo positivo negli studi sinergici [35, 72]. È interessante notare che l'1,8-cineolo, uno dei componenti importanti presenti nell'olio di galanga, è noto per i suoi effetti tossici sulle specie di insetti [22, 63, 73] ed è stato segnalato che ha effetti sinergici in diverse aree della ricerca sull'attività biologica [74]. . ,75,76,77]. Inoltre, l'1,8-cineolo in combinazione con vari farmaci tra cui curcumina [78], 5-fluorouracile [79], acido mefenamico [80] e zidovudina [81] ha anche un effetto di promozione della permeazione in vitro. Pertanto, il possibile ruolo dell'1,8-cineolo nell'azione insetticida sinergica non è solo quello di ingrediente attivo, ma anche quello di potenziatore della penetrazione. A causa del maggiore sinergismo con la permetrina, in particolare contro il PMD-R, gli effetti sinergici dell'olio di galanga e dell'olio di trichosanthes osservati in questo studio possono derivare da interazioni con meccanismi di resistenza, ovvero una maggiore permeabilità al cloro. I piretroidi aumentano l'attivazione dei composti accumulati e inibiscono gli enzimi detossificanti come le monoossigenasi del citocromo P450 e le carbossilesterasi. Tuttavia, questi aspetti richiedono ulteriori studi per chiarire il ruolo specifico dell'EO e dei suoi composti isolati (da soli o in combinazione) nei meccanismi sinergici.
Nel 1977, sono stati segnalati livelli crescenti di resistenza alla permetrina nelle principali popolazioni di vettori in Thailandia e, nei decenni successivi, l'uso della permetrina è stato ampiamente sostituito da altri prodotti chimici piretroidi, in particolare quelli sostituiti dalla deltametrina [82]. Tuttavia, la resistenza dei vettori alla deltametrina e ad altre classi di insetticidi è estremamente comune in tutto il paese a causa dell'uso eccessivo e persistente [14, 17, 83, 84, 85, 86]. Per combattere questo problema, si raccomanda di ruotare o riutilizzare i pesticidi scartati che erano precedentemente efficaci e meno tossici per i mammiferi, come la permetrina. Attualmente, sebbene l'uso della permetrina sia stato ridotto nei recenti programmi nazionali di controllo delle zanzare del governo, la resistenza alla permetrina può ancora essere riscontrata nelle popolazioni di zanzare. Ciò potrebbe essere dovuto all'esposizione delle zanzare a prodotti commerciali per il controllo dei parassiti domestici, che consistono principalmente in permetrina e altri piretroidi [14, 17]. Pertanto, un riutilizzo efficace della permetrina richiede lo sviluppo e l'implementazione di strategie per ridurre la resistenza dei vettori. Sebbene nessuno degli oli essenziali testati individualmente in questo studio sia stato efficace quanto la permetrina, la loro interazione con quest'ultima ha prodotto effetti sinergici notevoli. Questa è un'indicazione promettente che l'interazione dell'olio essenziale (OE) con i meccanismi di resistenza porta la combinazione di permetrina con OE a essere più efficace dell'insetticida o dell'OE da solo, in particolare contro Aedes aegypti, una specie con resistenza al PMD-R. I benefici delle miscele sinergiche nell'aumentare l'efficacia, nonostante l'uso di dosi inferiori per il controllo dei vettori, possono portare a una migliore gestione della resistenza e a una riduzione dei costi [33, 87]. Da questi risultati, è interessante notare che gli OE di A. galanga e C. rotundus sono stati significativamente più efficaci del PBO nel sinergizzare la tossicità della permetrina sia nei ceppi MCM-S che PMD-R e rappresentano una potenziale alternativa ai tradizionali adiuvanti ergogenici.
Gli oli essenziali selezionati hanno mostrato significativi effetti sinergici nell'aumentare la tossicità degli adulti contro PMD-R Ae. aegypti, in particolare l'olio di galanga, con un valore di SR fino a 1233,33, a indicare che gli oli essenziali sono ampiamente promettenti come sinergici nel potenziare l'efficacia della permetrina. Ciò potrebbe stimolare l'uso di un nuovo prodotto naturale attivo, che insieme potrebbero aumentare l'uso di prodotti altamente efficaci per il controllo delle zanzare. Inoltre, rivela il potenziale dell'ossido di etilene come sinergizzante alternativo per migliorare efficacemente gli insetticidi più vecchi o tradizionali e affrontare i problemi di resistenza esistenti nelle popolazioni di zanzare. L'utilizzo di piante facilmente reperibili nei programmi di controllo delle zanzare non solo riduce la dipendenza da materiali importati e costosi, ma stimola anche gli sforzi locali per rafforzare i sistemi sanitari pubblici.
Questi risultati mostrano chiaramente il significativo effetto sinergico prodotto dalla combinazione di ossido di etilene e permetrina. I risultati evidenziano il potenziale dell'ossido di etilene come sinergizzante vegetale nel controllo delle zanzare, aumentando l'efficacia della permetrina contro le zanzare, soprattutto nelle popolazioni resistenti. Sviluppi e ricerche futuri richiederanno bioanalisi sinergiche di oli di galanga e alpinia e dei loro composti isolati, combinazioni di insetticidi di origine naturale o sintetica contro diverse specie e stadi di zanzara e test di tossicità contro organismi non bersaglio. Uso pratico dell'ossido di etilene come sinergizzante alternativo valido.
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Data di pubblicazione: 08-07-2024