In un precedente progetto di test sugli impianti locali di trasformazione alimentare per le zanzare in Thailandia, è stato scoperto che gli oli essenziali (OE) di Cyperus rotundus, galanga e cannella avevano una buona attività antizanzare contro Aedes aegypti. Nel tentativo di ridurre l'uso di metodi tradizionaliinsetticidie migliorare il controllo delle popolazioni di zanzare resistenti, questo studio si è proposto di identificare il potenziale sinergismo tra gli effetti adulticidi dell'ossido di etilene e la tossicità della permetrina sulle zanzare Aedes aegypti, comprese le ceppi resistenti e sensibili ai piretroidi.
Per valutare la composizione chimica e l'attività letale dell'olio essenziale estratto dai rizomi di C. rotundus e A. galanga e dalla corteccia di C. verum contro il ceppo suscettibile Muang Chiang Mai (MCM-S) e il ceppo resistente Pang Mai Dang (PMD-R). ) Adulti attivi di Ae. Aedes aegypti. È stato inoltre eseguito un bioassay sugli adulti della miscela olio essenziale-permetrina su questi ceppi di Aedes aegypti per comprenderne l'attività sinergica.
La caratterizzazione chimica mediante metodo analitico GC-MS ha mostrato che 48 composti sono stati identificati negli oli essenziali di C. rotundus, A. galanga e C. verum, rappresentando rispettivamente l'80,22%, l'86,75% e il 97,24% dei componenti totali. Il ciperene (14,04%), il β-bisabolene (18,27%) e la cinnamaldeide (64,66%) sono i componenti principali rispettivamente dell'olio di cipero, dell'olio di galanga e dell'olio balsamico. Nei test biologici di uccisione degli adulti, le vescicole extracellulari di C. rotundus, A. galanga e C. verum sono risultate efficaci nell'uccidere Ae. I valori di LD50 di MCM-S e PMD-R per Aedes aegypti erano rispettivamente 10,05 e 9,57 μg/mg femmina, 7,97 e 7,94 μg/mg femmina e 3,30 e 3,22 μg/mg femmina. L'efficacia di MCM-S e PMD-R nell'uccidere gli adulti di Aedes aegypti in questi oli essenziali era vicina al piperonil butossido (valori di PBO, LD50 = 6,30 e 4,79 μg/mg femmina, rispettivamente), ma non così pronunciata come la permetrina (valori di LD50 = 0,44 e 3,70 ng/mg femmina rispettivamente). Tuttavia, i bioassay di combinazione hanno trovato sinergia tra olio essenziale e permetrina. Significativo sinergismo con la permetrina contro due ceppi di zanzare Aedes. Aedes aegypti è stato rilevato nell'EM di C. rotundus e A. galanga. L'aggiunta di oli di C. rotundus e A. galanga ha ridotto significativamente i valori di LD50 della permetrina su MCM-S da 0,44 a 0,07 ng/mg e 0,11 ng/mg nelle femmine, rispettivamente, con valori di rapporto di sinergia (SR) di 6,28 e 4,00 rispettivamente. Inoltre, gli EO di C. rotundus e A. galanga hanno anche ridotto significativamente i valori di LD50 della permetrina su PMD-R da 3,70 a 0,42 ng/mg e 0,003 ng/mg nelle femmine, rispettivamente, con valori di SR di 8,81 e 1233,33, rispettivamente.
Effetto sinergico di una combinazione di ossido di etilene e permetrina per potenziare la tossicità sugli adulti contro due ceppi di zanzare Aedes. Aedes aegypti dimostra un ruolo promettente dell'ossido di etilene come sinergizzante nel migliorare l'efficacia antizanzare, soprattutto laddove i composti tradizionali sono inefficaci o inappropriati.
La zanzara Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) è il principale vettore della febbre dengue e di altre malattie virali infettive come la febbre gialla, la chikungunya e il virus Zika, rappresentando una minaccia enorme e persistente per l'uomo [1, 2]. Il virus della dengue è la febbre emorragica patogena più grave che colpisce l'uomo, con una stima di 5-100 milioni di casi all'anno e oltre 2,5 miliardi di persone a rischio in tutto il mondo [3]. Le epidemie di questa malattia infettiva gravano pesantemente sulle popolazioni, sui sistemi sanitari e sulle economie della maggior parte dei paesi tropicali [1]. Secondo il Ministero della Salute thailandese, nel 2015 sono stati segnalati a livello nazionale 142.925 casi di febbre dengue e 141 decessi, più del triplo rispetto al numero di casi e decessi del 2014 [4]. Nonostante le prove storiche, la febbre dengue è stata eradicata o notevolmente ridotta dalla zanzara Aedes. A seguito del controllo di Aedes aegypti [5], i tassi di infezione sono aumentati drasticamente e la malattia si è diffusa in tutto il mondo, in parte a causa di decenni di riscaldamento globale. L'eliminazione e il controllo di Ae. Aedes aegypti sono relativamente difficili perché si tratta di una zanzara vettore domestica che si accoppia, si nutre, riposa e depone le uova all'interno e intorno agli insediamenti umani durante il giorno. Inoltre, questa zanzara ha la capacità di adattarsi ai cambiamenti ambientali o ai disturbi causati da eventi naturali (come la siccità) o da misure di controllo umane, e può tornare ai suoi numeri originali [6, 7]. Poiché i vaccini contro la dengue sono stati approvati solo di recente e non esiste un trattamento specifico per la dengue, la prevenzione e la riduzione del rischio di trasmissione della dengue dipendono interamente dal controllo delle zanzare vettrici e dall'eliminazione del contatto umano con i vettori.
In particolare, l'uso di sostanze chimiche per il controllo delle zanzare riveste oggi un ruolo importante nella salute pubblica come componente fondamentale di una gestione integrata e completa dei vettori. I metodi chimici più diffusi includono l'uso di insetticidi a bassa tossicità che agiscono contro le larve di zanzara (larvicidi) e le zanzare adulte (adidocidi). Il controllo delle larve attraverso la riduzione delle fonti e l'uso regolare di larvicidi chimici come organofosfati e regolatori della crescita degli insetti è considerato importante. Tuttavia, gli impatti ambientali negativi associati ai pesticidi sintetici e la loro manutenzione complessa e ad alta intensità di manodopera rimangono una delle principali preoccupazioni [8, 9]. Il controllo attivo tradizionale dei vettori, come il controllo degli adulti, rimane il mezzo di controllo più efficace durante le epidemie virali perché può eradicare rapidamente e su larga scala i vettori di malattie infettive, nonché ridurre la durata della vita e la longevità delle popolazioni locali di vettori [3, 10]. Quattro classi di insetticidi chimici: organoclorurati (indicati semplicemente come DDT), organofosfati, carbammati e piretroidi, costituiscono la base dei programmi di controllo dei vettori, con i piretroidi considerati la classe di maggior successo. Sono altamente efficaci contro vari artropodi e presentano una bassa tossicità per i mammiferi. Attualmente, i piretroidi sintetici costituiscono la maggior parte dei pesticidi commerciali, rappresentando circa il 25% del mercato globale dei pesticidi [11, 12]. La permetrina e la deltametrina sono insetticidi piretroidi ad ampio spettro utilizzati in tutto il mondo da decenni per controllare una varietà di parassiti di importanza agricola e medica [13, 14]. Negli anni '50, il DDT fu scelto come sostanza chimica di elezione per il programma nazionale di controllo delle zanzare per la salute pubblica in Thailandia. A seguito dell'uso diffuso del DDT nelle aree endemiche per la malaria, la Thailandia ha gradualmente eliminato l'uso del DDT tra il 1995 e il 2000, sostituendolo con due piretroidi: permetrina e deltametrina [15, 16]. Questi insetticidi piretroidi sono stati introdotti all'inizio degli anni '90 per il controllo della malaria e della dengue, principalmente attraverso trattamenti con zanzariere e l'uso di nebulizzazioni termiche e spray a bassissima tossicità [14, 17]. Tuttavia, hanno perso efficacia a causa della forte resistenza delle zanzare e della scarsa adesione da parte del pubblico, dovuta alle preoccupazioni per la salute pubblica e l'impatto ambientale delle sostanze chimiche sintetiche. Ciò pone sfide significative al successo dei programmi di controllo dei vettori di minaccia [14, 18, 19]. Per rendere la strategia più efficace, sono necessarie contromisure tempestive e appropriate. Le procedure di gestione raccomandate includono la sostituzione con sostanze naturali, la rotazione di sostanze chimiche di diverse classi, l'aggiunta di sinergizzanti e la miscelazione di sostanze chimiche o l'applicazione simultanea di sostanze chimiche di diverse classi [14, 20, 21]. Pertanto, è urgente trovare e sviluppare un'alternativa e un agente sinergico ecocompatibili, pratici ed efficaci, e questo studio si propone di rispondere a tale esigenza.
Gli insetticidi di origine naturale, in particolare quelli a base di componenti vegetali, hanno mostrato un potenziale nella valutazione delle alternative attuali e future per il controllo delle zanzare [22, 23, 24]. Diversi studi hanno dimostrato che è possibile controllare importanti vettori di zanzare utilizzando prodotti vegetali, in particolare oli essenziali (OE), come insetticidi per gli adulti. Proprietà adulticide contro alcune importanti specie di zanzare sono state riscontrate in molti oli vegetali come sedano, cumino, zedoaria, anice, pepe nero, timo, Schinus terebinthifolia, Cymbopogon citratus, Cymbopogon schoenanthus, Cymbopogon giganteus, Chenopodium ambrosioides, Cochlospermum planchonii, Eucalyptus ter eticornis, Eucalyptus citriodora, Cananga odorata e Petroselinum Criscum [25,26,27,28,29,30]. L'ossido di etilene viene ora utilizzato non solo da solo, ma anche in combinazione con sostanze vegetali estratte o pesticidi sintetici esistenti, producendo diversi gradi di tossicità. Le combinazioni di insetticidi tradizionali come organofosfati, carbammati e piretroidi con ossido di etilene/estratti vegetali agiscono in modo sinergico o antagonistico nei loro effetti tossici e si sono dimostrate efficaci contro vettori di malattie e parassiti [31,32,33,34,35]. Tuttavia, la maggior parte degli studi sugli effetti tossici sinergici delle combinazioni di fitochimici con o senza sostanze chimiche sintetiche sono stati condotti su insetti vettori e parassiti agricoli piuttosto che su zanzare di importanza medica. Inoltre, la maggior parte del lavoro sugli effetti sinergici delle combinazioni di insetticidi vegetali e sintetici contro i vettori di zanzare si è concentrata sull'effetto larvicida.
In uno studio precedente condotto dagli autori nell'ambito di un progetto di ricerca in corso per lo screening di intimicidi da piante alimentari autoctone in Thailandia, è stato scoperto che gli ossidi di etilene di Cyperus rotundus, galanga e cannella hanno una potenziale attività contro gli adulti di Aedes aegypti [36]. Pertanto, questo studio mirava a valutare l'efficacia degli OE isolati da queste piante medicinali contro le zanzare Aedes aegypti, comprese le ceppi resistenti e sensibili ai piretroidi. È stato anche analizzato l'effetto sinergico di miscele binarie di ossido di etilene e piretroidi sintetici con buona efficacia negli adulti per ridurre l'uso di insetticidi tradizionali e aumentare la resistenza ai vettori di zanzare, in particolare contro Aedes aegypti. Questo articolo riporta la caratterizzazione chimica di oli essenziali efficaci e il loro potenziale per aumentare la tossicità della permetrina sintetica contro le zanzare Aedes aegypti in ceppi sensibili ai piretroidi (MCM-S) e ceppi resistenti (PMD-R).
I rizomi di C. rotundus e A. galanga e la corteccia di C. verum (Fig. 1), utilizzati per l'estrazione dell'olio essenziale, sono stati acquistati da fornitori di erbe medicinali nella provincia di Chiang Mai, in Thailandia. L'identificazione scientifica di queste piante è stata effettuata consultando il Sig. James Franklin Maxwell, botanico dell'erbario del Dipartimento di Biologia, Facoltà di Scienze, Università di Chiang Mai (CMU), provincia di Chiang Mai, Thailandia, e la scienziata Wannari Charoensap, del Dipartimento di Farmacia, Facoltà di Farmacia, Università Carnegie Mellon. Gli esemplari di ciascuna pianta sono conservati presso il Dipartimento di Parassitologia della Facoltà di Medicina dell'Università Carnegie Mellon per usi futuri.
I campioni vegetali sono stati essiccati singolarmente all'ombra per 3-5 giorni in un ambiente aperto con ventilazione attiva e una temperatura ambiente di circa 30 ± 5 °C per rimuovere l'umidità prima dell'estrazione degli oli essenziali naturali (OE). Un totale di 250 g di ciascun materiale vegetale essiccato è stato macinato meccanicamente fino a ottenere una polvere grossolana e utilizzato per isolare gli oli essenziali (OE) mediante distillazione in corrente di vapore. L'apparecchiatura di distillazione era composta da un mantello riscaldante elettrico, un pallone a fondo tondo da 3000 mL, una colonna di estrazione, un condensatore e un dispositivo Cool Ace (Eyela Cool Ace CA-1112 CE, Tokyo Rikakikai Co. Ltd., Tokyo, Giappone). Aggiungere 1600 ml di acqua distillata e 10-15 sfere di vetro al pallone e riscaldarlo a circa 100 °C utilizzando un riscaldatore elettrico per almeno 3 ore fino al completamento della distillazione e all'assenza di produzione di OE. Lo strato di olio essenziale è stato separato dalla fase acquosa utilizzando un imbuto separatore, essiccato su solfato di sodio anidro (Na2SO4) e conservato in una bottiglia di vetro scuro sigillata a 4 °C fino all'esame della composizione chimica e dell'attività degli adulti.
La composizione chimica degli oli essenziali è stata determinata simultaneamente al saggio biologico per la sostanza adulta. L'analisi qualitativa è stata eseguita utilizzando un sistema GC-MS costituito da un gascromatografo Hewlett-Packard (Wilmington, CA, USA) 7890A dotato di un singolo rivelatore di massa a quadrupolo selettivo (Agilent Technologies, Wilmington, CA, USA) e uno spettrometro di massa MSD 5975C (EI) (Agilent Technologies).
Colonna cromatografica – DB-5MS (30 m × ID 0,25 mm × spessore del film 0,25 µm). Il tempo totale di analisi GC-MS è stato di 20 minuti. Le condizioni di analisi sono le seguenti: temperature dell'iniettore e della linea di trasferimento rispettivamente di 250 e 280 °C; temperatura del forno impostata per aumentare da 50 °C a 250 °C con una velocità di 10 °C/min; gas vettore elio; flusso 1,0 ml/min; volume di iniezione 0,2 µL (1/10% in volume in CH2Cl2, rapporto di split 100:1); per la rilevazione GC-MS viene utilizzato un sistema di ionizzazione elettronica con un'energia di ionizzazione di 70 eV. L'intervallo di acquisizione è 50–550 unità di massa atomica (uma) e la velocità di scansione è di 2,91 scansioni al secondo. Le percentuali relative dei componenti sono espresse come percentuali normalizzate rispetto all'area del picco. L'identificazione degli ingredienti dell'EO si basa sul loro indice di ritenzione (RI). L'RI è stato calcolato utilizzando l'equazione di Van den Dool e Kratz [37] per la serie degli n-alcani (C8-C40) e confrontato con gli indici di ritenzione della letteratura [38] e dei database di libreria (NIST 2008 e Wiley 8NO8). L'identità dei composti mostrati, come la struttura e la formula molecolare, è stata confermata mediante confronto con campioni autentici disponibili.
Gli standard analitici per la permetrina sintetica e il piperonil butossido (PBO, controllo positivo negli studi di sinergia) sono stati acquistati da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). I kit per i test diagnostici per adulti dell'Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS) e le dosi diagnostiche di carta impregnata di permetrina (0,75%) sono stati acquistati dal Centro di controllo dei vettori dell'OMS a Penang, Malesia. Tutti gli altri prodotti chimici e reagenti utilizzati erano di grado analitico e sono stati acquistati da istituzioni locali nella provincia di Chiang Mai, Thailandia.
Le zanzare utilizzate come organismi di prova nel bioassay adulto erano zanzare Aedes aegypti di laboratorio a libero accoppiamento, tra cui il ceppo suscettibile Muang Chiang Mai (MCM-S) e il ceppo resistente Pang Mai Dang (PMD-R). Il ceppo MCM-S è stato ottenuto da campioni locali raccolti nell'area di Muang Chiang Mai, provincia di Chiang Mai, Thailandia, ed è stato mantenuto nella stanza di entomologia del Dipartimento di Parassitologia, CMU School of Medicine, dal 1995 [39]. Il ceppo PMD-R, che è risultato resistente alla permetrina, è stato isolato da zanzare di campo originariamente raccolte da Ban Pang Mai Dang, distretto di Mae Tang, provincia di Chiang Mai, Thailandia, ed è stato mantenuto nello stesso istituto dal 1997 [40]. I ceppi PMD-R sono stati coltivati sotto pressione selettiva per mantenere i livelli di resistenza mediante esposizione intermittente allo 0,75% di permetrina utilizzando il kit di rilevamento dell'OMS con alcune modifiche [41]. Ogni ceppo di Ae. Le larve di Aedes aegypti sono state allevate singolarmente in un laboratorio privo di patogeni a 25 ± 2 °C e 80 ± 10% di umidità relativa e con un fotoperiodo di 14:10 ore luce/buio. Circa 200 larve sono state mantenute in vassoi di plastica (33 cm di lunghezza, 28 cm di larghezza e 9 cm di altezza) riempiti con acqua di rubinetto a una densità di 150-200 larve per vassoio e nutrite due volte al giorno con biscotti per cani sterilizzati. I vermi adulti sono stati mantenuti in gabbie umide e nutriti continuamente con una soluzione acquosa di saccarosio al 10% e una soluzione di sciroppo multivitaminico al 10%. Le zanzare femmine succhiano regolarmente il sangue per deporre le uova. Le femmine di età compresa tra due e cinque giorni che non sono state nutrite con sangue possono essere utilizzate continuamente in test biologici sperimentali sugli adulti.
È stato eseguito un saggio biologico dose-mortalità dell'EO su zanzare femmine adulte di Aedes aegypti, MCM-S e PMD-R utilizzando un metodo topico modificato secondo il protocollo standard dell'OMS per i test di suscettibilità [42]. L'EO di ciascuna pianta è stato diluito in serie con un solvente adatto (ad esempio etanolo o acetone) per ottenere una serie graduata di 4-6 concentrazioni. Dopo l'anestesia con anidride carbonica (CO2), le zanzare sono state pesate singolarmente. Le zanzare anestetizzate sono state quindi mantenute immobili su carta da filtro asciutta su una piastra fredda personalizzata sotto uno stereomicroscopio per prevenire la riattivazione durante la procedura. Per ogni trattamento, 0,1 μl di soluzione di EO sono stati applicati al pronoto superiore della femmina utilizzando un microdispensatore portatile Hamilton (700 Series Microliter™, Hamilton Company, Reno, NV, USA). Venticinque femmine sono state trattate con ciascuna concentrazione, con una mortalità che variava dal 10% al 95% per almeno 4 diverse concentrazioni. Le zanzare trattate con solvente sono servite da controllo. Per prevenire la contaminazione dei campioni di prova, la carta da filtro è stata sostituita con una nuova carta da filtro per ogni olio essenziale testato. Le dosi utilizzate in questi bioassay sono espresse in microgrammi di olio essenziale per milligrammo di peso corporeo di femmina vivente. L'attività della PBO adulta è stata valutata in modo simile all'olio essenziale, con la PBO utilizzata come controllo positivo negli esperimenti sinergici. Le zanzare trattate in tutti i gruppi sono state poste in bicchieri di plastica e nutrite con una soluzione di saccarosio al 10% più sciroppo multivitaminico al 10%. Tutti i bioassay sono stati eseguiti a 25 ± 2 °C e 80 ± 10% di umidità relativa e ripetuti quattro volte con i controlli. La mortalità durante il periodo di allevamento di 24 ore è stata verificata e confermata dalla mancanza di risposta della zanzara alla stimolazione meccanica e quindi registrata in base alla media di quattro repliche. I trattamenti sperimentali sono stati ripetuti quattro volte per ciascun campione di prova utilizzando lotti diversi di zanzare. I risultati sono stati riassunti e utilizzati per calcolare la percentuale di mortalità, che è stata poi impiegata per determinare la dose letale a 24 ore mediante analisi probit.
L'effetto anticida sinergico di EO e permetrina è stato valutato utilizzando una procedura di saggio di tossicità locale [42] come precedentemente descritto. Utilizzare acetone o etanolo come solvente per preparare la permetrina alla concentrazione desiderata, così come una miscela binaria di EO e permetrina (EO-permetrina: permetrina miscelata con EO alla concentrazione LD25). I kit di test (permetrina e EO-permetrina) sono stati valutati contro i ceppi MCM-S e PMD-R di Ae. Aedes aegypti. A ciascuna delle 25 zanzare femmine sono state somministrate quattro dosi di permetrina per testarne l'efficacia nell'uccidere gli adulti, con ogni trattamento ripetuto quattro volte. Per identificare i potenziali sinergizzanti EO, sono state somministrate da 4 a 6 dosi di EO-permetrina a ciascuna delle 25 zanzare femmine, con ogni applicazione ripetuta quattro volte. Il trattamento PBO-permetrina (permetrina miscelata con la concentrazione LD25 di PBO) è servito anche come controllo positivo. Le dosi utilizzate in questi bioassay sono espresse in nanogrammi di campione di prova per milligrammo di peso corporeo di zanzare femmine vive. Per ogni ceppo di zanzara sono state condotte quattro valutazioni sperimentali su lotti allevati individualmente e i dati di mortalità sono stati aggregati e analizzati utilizzando il modello Probit per determinare la dose letale a 24 ore.
Il tasso di mortalità è stato aggiustato utilizzando la formula di Abbott [43]. I dati aggiustati sono stati analizzati mediante analisi di regressione Probit utilizzando il programma di statistica computerizzata SPSS (versione 19.0). I valori letali del 25%, 50%, 90%, 95% e 99% (LD25, LD50, LD90, LD95 e LD99, rispettivamente) sono stati calcolati utilizzando i corrispondenti intervalli di confidenza al 95% (95% CI). Le misure di significatività e le differenze tra i campioni di prova sono state valutate utilizzando il test del chi-quadrato o il test U di Mann-Whitney all'interno di ciascun saggio biologico. I risultati sono stati considerati statisticamente significativi a P< 0,05. Il coefficiente di resistenza (RR) viene stimato al livello LD50 utilizzando la seguente formula [12]:
RR > 1 indica resistenza e RR ≤ 1 indica sensibilità. Il valore del rapporto di sinergia (SR) di ciascun candidato sinergista viene calcolato come segue [34, 35, 44]:
Questo fattore divide i risultati in tre categorie: un valore SR di 1±0,05 è considerato privo di effetto apparente, un valore SR >1,05 è considerato avere un effetto sinergico e un valore SR di Un olio liquido giallo chiaro può essere ottenuto mediante distillazione in corrente di vapore dei rizomi di C. rotundus e A. galanga e della corteccia di C. verum. Le rese calcolate sul peso secco erano rispettivamente dello 0,15%, 0,27% (p/p) e 0,54% (v/v). (p) (Tabella 1). Lo studio GC-MS della composizione chimica degli oli di C. rotundus, A. galanga e C. verum ha mostrato la presenza di 19, 17 e 21 composti, che rappresentavano rispettivamente l'80,22%, l'86,75% e il 97,24% di tutti i componenti (Tabella 2). I composti dell'olio del rizoma di C. lucidum sono costituiti principalmente da ciperonene (14,04%), seguito da carralene (9,57%), α-capsellano (7,97%) e α-capsellano (7,53%). Il principale componente chimico dell'olio del rizoma di galanga è il β-bisabolene (18,27%), seguito da α-bergamotene (16,28%), 1,8-cineolo (10,17%) e piperonolo (10,09%). Mentre la cinnamaldeide (64,66%) è stata identificata come il componente principale dell'olio della corteccia di C. verum, l'acetato cinnamico (6,61%), l'α-copaene (5,83%) e la 3-fenilpropionaldeide (4,09%) sono stati considerati ingredienti minori. Le strutture chimiche del ciperne, del β-bisabolene e della cinnamaldeide sono i principali composti di C. rotundus, A. galanga e C. verum, rispettivamente, come mostrato nella Figura 2.
I risultati di tre oli essenziali (OE) hanno valutato l'attività degli adulti contro le zanzare Aedes aegypti. Tutti gli OE hanno mostrato effetti letali sulle zanzare Aedes aegypti MCM-S a diversi tipi e dosi. L'OE più efficace è C. verum, seguito da A. galanga e C. rotundus con valori di LD50 rispettivamente di 3,30, 7,97 e 10,05 μg/mg MCM-S femmine, leggermente superiori a 3,22 (U = 1), Z = -0,775, P = 0,667), 7,94 (U = 2, Z = 0, P = 1) e 9,57 (U = 0, Z = -1,549, P = 0,333) μg/mg PMD-R nelle donne. Ciò corrisponde a un effetto leggermente maggiore del PBO sugli adulti del ceppo PMD-R rispetto al ceppo MSM-S, con valori di LD50 di 4,79 e 6,30 μg/mg femmine, rispettivamente (U = 0, Z = -2,021, P = 0,057). Si può calcolare che i valori di LD50 di C. verum, A. galanga, C. rotundus e PBO contro PMD-R sono circa 0,98, 0,99, 0,95 e 0,76 volte inferiori a quelli contro MCM-S, rispettivamente. Pertanto, ciò indica che la suscettibilità al PBO e all'EO è relativamente simile tra i due ceppi di Aedes. Sebbene PMD-R fosse più suscettibile di MCM-S, la sensibilità di Aedes aegypti non era significativa. Al contrario, i due ceppi di Aedes differivano notevolmente nella loro sensibilità alla permetrina. aegypti (Tabella 4). PMD-R ha dimostrato una significativa resistenza alla permetrina (valore LD50 = 0,44 ng/mg nelle donne) con un valore LD50 più alto di 3,70 rispetto a MCM-S (valore LD50 = 0,44 ng/mg nelle donne) ng/mg nelle donne (U = 0, Z = -2,309, P = 0,029). Sebbene PMD-R sia molto meno sensibile alla permetrina rispetto a MCM-S, la sua sensibilità a PBO e agli oli di C. verum, A. galanga e C. rotundus è leggermente superiore a quella di MCM-S.
Come osservato nel bioassay sulla popolazione adulta della combinazione EO-permetrina, le miscele binarie di permetrina ed EO (LD25) hanno mostrato sinergia (valore SR > 1,05) o nessun effetto (valore SR = 1 ± 0,05). Effetti complessi sugli adulti di una miscela EO-permetrina su zanzare albine sperimentali. I ceppi di Aedes aegypti MCM-S e PMD-R sono mostrati nella Tabella 4 e nella Figura 3. L'aggiunta di olio di C. verum ha ridotto leggermente la LD50 della permetrina contro MCM-S e ha leggermente aumentato la LD50 contro PMD-R a 0,44–0,42 ng/mg nelle donne e da 3,70 a 3,85 ng/mg nelle donne, rispettivamente. Al contrario, l'aggiunta di oli di C. rotundus e A. galanga ha ridotto significativamente la LD50 della permetrina su MCM-S da 0,44 a 0,07 (U = 0, Z = -2,309, P = 0,029) e a 0,11 (U = 0). , Z) = -2,309, P = 0,029) ng/mg donne. Sulla base dei valori di LD50 di MCM-S, i valori SR della miscela EO-permetrina dopo l'aggiunta di oli di C. rotundus e A. galanga erano rispettivamente 6,28 e 4,00. Di conseguenza, la LD50 della permetrina contro PMD-R è diminuita significativamente da 3,70 a 0,42 (U = 0, Z = -2,309, P = 0,029) e a 0,003 con l'aggiunta di oli di C. rotundus e A. galanga (U = 0). , Z = -2,337, P = 0,029) ng/mg femmina. Il valore SR della permetrina combinata con C. rotundus contro PMD-R era 8,81, mentre il valore SR della miscela galanga-permetrina era 1233,33. Rispetto a MCM-S, il valore LD50 del controllo positivo PBO è diminuito da 0,44 a 0,26 ng/mg (femmine) e da 3,70 ng/mg (femmine) a 0,65 ng/mg (U = 0, Z = -2,309, P = 0,029) e PMD-R (U = 0, Z = -2,309, P = 0,029). I valori SR della miscela PBO-permetrina per i ceppi MCM-S e PMD-R erano rispettivamente 1,69 e 5,69. Questi risultati indicano che gli oli di C. rotundus e A. galanga e PBO aumentano la tossicità della permetrina in misura maggiore rispetto all'olio di C. verum per i ceppi MCM-S e PMD-R.
Attività adulta (LD50) di EO, PBO, permetrina (PE) e loro combinazioni contro ceppi di zanzare Aedes sensibili ai piretroidi (MCM-S) e resistenti (PMD-R). Aedes aegypti
[45]. I piretroidi sintetici sono utilizzati in tutto il mondo per controllare quasi tutti gli artropodi di importanza agricola e medica. Tuttavia, a causa delle conseguenze dannose dell'uso di insetticidi sintetici, in particolare in termini di sviluppo e diffusa resistenza delle zanzare, nonché dell'impatto sulla salute a lungo termine e sull'ambiente, ora è urgente ridurre l'uso di insetticidi sintetici tradizionali e sviluppare alternative [35, 46, 47]. Oltre a proteggere l'ambiente e la salute umana, i vantaggi degli insetticidi botanici includono l'elevata selettività, la disponibilità globale e la facilità di produzione e utilizzo, rendendoli più attraenti per il controllo delle zanzare [32, 48, 49]. Questo studio, oltre a chiarire le caratteristiche chimiche degli oli essenziali efficaci attraverso l'analisi GC-MS, ha anche valutato la potenza degli oli essenziali adulti e la loro capacità di aumentare la tossicità della permetrina sintetica. aegypti in ceppi sensibili ai piretroidi (MCM-S) e ceppi resistenti (PMD-R).
La caratterizzazione GC-MS ha mostrato che il ciperne (14,04%), il β-bisabolene (18,27%) e la cinnamaldeide (64,66%) erano i componenti principali degli oli di C. rotundus, A. galanga e C. verum, rispettivamente. Queste sostanze chimiche hanno dimostrato diverse attività biologiche. Ahn et al. [50] hanno riportato che il 6-acetossiciperene, isolato dal rizoma di C. rotundus, agisce come un composto antitumorale e può indurre apoptosi dipendente dalla caspasi nelle cellule del cancro ovarico. Il β-bisabolene, estratto dall'olio essenziale dell'albero di mirra, mostra una citotossicità specifica contro le cellule tumorali mammarie umane e murine sia in vitro che in vivo [51]. È stato riportato che la cinnamaldeide, ottenuta da estratti naturali o sintetizzata in laboratorio, possiede attività insetticide, antibatteriche, antifungine, antinfiammatorie, immunomodulatorie, anticancerogene e antiangiogeniche [52].
I risultati del bioassay di attività adulta dose-dipendente hanno mostrato un buon potenziale degli EO testati e hanno mostrato che i ceppi di zanzara Aedes MCM-S e PMD-R avevano una suscettibilità simile a EO e PBO. Aedes aegypti. Un confronto dell'efficacia di EO e permetrina ha mostrato che quest'ultima ha un effetto allercico più forte: i valori di LD50 sono 0,44 e 3,70 ng/mg nelle femmine per i ceppi MCM-S e PMD-R, rispettivamente. Questi risultati sono supportati da molti studi che mostrano che i pesticidi presenti in natura, in particolare i prodotti derivati dalle piante, sono generalmente meno efficaci delle sostanze sintetiche [31, 34, 35, 53, 54]. Ciò può essere dovuto al fatto che i primi sono una combinazione complessa di ingredienti attivi o inattivi, mentre i secondi sono un singolo composto attivo purificato. Tuttavia, la diversità e la complessità degli ingredienti attivi naturali con diversi meccanismi d'azione possono aumentare l'attività biologica o ostacolare lo sviluppo di resistenza nelle popolazioni ospiti [55, 56, 57]. Numerosi ricercatori hanno segnalato il potenziale antizanzare di C. verum, A. galanga e C. rotundus e dei loro componenti come β-bisabolene, cinnamaldeide e 1,8-cineolo [22, 36, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64]. Tuttavia, una revisione della letteratura ha rivelato che non ci sono state segnalazioni precedenti del suo effetto sinergico con la permetrina o altri insetticidi sintetici contro le zanzare Aedes. Aedes aegypti.
In questo studio, sono state osservate differenze significative nella suscettibilità alla permetrina tra i due ceppi di Aedes. Aedes aegypti. MCM-S è sensibile alla permetrina, mentre PMD-R è molto meno sensibile, con un tasso di resistenza dell'8,41. Rispetto alla sensibilità di MCM-S, PMD-R è meno sensibile alla permetrina ma più sensibile all'olio essenziale (EO), fornendo una base per ulteriori studi volti ad aumentare l'efficacia della permetrina combinandola con l'EO. Un bioassay basato sulla combinazione sinergica per gli effetti sugli adulti ha mostrato che miscele binarie di EO e permetrina hanno ridotto o aumentato la mortalità degli adulti di Aedes. Aedes aegypti. L'aggiunta di olio di C. verum ha leggermente diminuito la LD50 della permetrina contro MCM-S ma leggermente aumentata la LD50 contro PMD-R con valori SR rispettivamente di 1,05 e 0,96. Ciò indica che l'olio di C. verum non ha un effetto sinergico o antagonista sulla permetrina quando testato su MCM-S e PMD-R. Al contrario, gli oli di C. rotundus e A. galanga hanno mostrato un significativo effetto sinergico riducendo significativamente i valori di LD50 della permetrina su MCM-S o PMD-R. Quando la permetrina è stata combinata con l'olio essenziale di C. rotundus e A. galanga, i valori di SR della miscela olio essenziale-permetrina per MCM-S erano rispettivamente 6,28 e 4,00. Inoltre, quando la permetrina è stata valutata contro PMD-R in combinazione con C. rotundus (SR = 8,81) o A. galanga (SR = 1233,33), i valori di SR sono aumentati significativamente. Vale la pena notare che sia C. rotundus che A. galanga hanno aumentato significativamente la tossicità della permetrina contro PMD-R Ae. aegypti. Analogamente, è stato riscontrato che il PBO aumenta la tossicità della permetrina con valori SR di 1,69 e 5,69 rispettivamente per i ceppi MCM-S e PMD-R. Poiché C. rotundus e A. galanga presentavano i valori SR più elevati, sono stati considerati i migliori sinergizzanti nell'aumentare la tossicità della permetrina rispettivamente su MCM-S e PMD-R.
Diversi studi precedenti hanno riportato l'effetto sinergico di combinazioni di insetticidi sintetici ed estratti vegetali contro varie specie di zanzare. Un bioassay larvicida contro Anopheles Stephensi studiato da Kalayanasundaram e Das [65] ha mostrato che il fenthion, un organofosfato ad ampio spettro, era associato a Cleodendron inerme, Pedalium murax e Parthenium hysterophorus. È stata osservata una significativa sinergia tra gli estratti con un effetto sinergico (SF) di 1,31, 1,38, 1,40, 1,48, 1,61 e 2,23, rispettivamente. In uno screening larvicida di 15 specie di mangrovie, l'estratto di etere di petrolio delle radici aeree di mangrovie è risultato essere il più efficace contro Culex quinquefasciatus con un valore LC50 di 25,7 mg/L [66]. È stato anche riportato che l'effetto sinergico di questo estratto e dell'insetticida botanico piretro riduce la LC50 del piretro contro le larve di C. quinquefasciatus da 0,132 mg/L a 0,107 mg/L, inoltre, in questo studio è stato utilizzato un calcolo SF di 1,23. 34,35,44]. L'efficacia combinata dell'estratto di radice di Solanum citron e di diversi insetticidi sintetici (ad esempio, fenthion, cipermetrina (un piretroide sintetico) e timethphos (un larvicida organofosforico)) contro le zanzare Anopheles è stata valutata. Stephensi [54] e C. quinquefasciatus [34]. L'uso combinato di cipermetrina ed estratto di etere di petrolio di frutto giallo ha mostrato un effetto sinergico sulla cipermetrina in tutti i rapporti. Il rapporto più efficace è stato la combinazione binaria 1:1 con valori di LC50 e SF rispettivamente di 0,0054 ppm e 6,83, rispetto ad An. Stephen West[54]. Mentre una miscela binaria 1:1 di S. xanthocarpum e temefos era antagonista (SF = 0,6406), la combinazione S. xanthocarpum-fenthion (1:1) ha mostrato attività sinergica contro C. quinquefasciatus con un SF di 1,3125 [ 34]]. Tong e Blomquist [35] hanno studiato gli effetti dell'ossido di etilene vegetale sulla tossicità del carbaryl (un carbammato ad ampio spettro) e della permetrina per le zanzare Aedes. Aedes aegypti. I risultati hanno mostrato che l'ossido di etilene da agar, pepe nero, ginepro, elicriso, sandalo e sesamo ha aumentato la tossicità del carbaryl per le zanzare Aedes. I valori SR delle larve di Aedes aegypti variano da 1,0 a 7,0. Al contrario, nessuno degli oli essenziali (EO) è risultato tossico per le zanzare Aedes adulte. In questa fase, non sono stati segnalati effetti sinergici per la combinazione di Aedes aegypti e EO-carbaryl. Il PBO è stato utilizzato come controllo positivo per aumentare la tossicità del carbaryl contro le zanzare Aedes. I valori SR delle larve e degli adulti di Aedes aegypti sono rispettivamente 4,9-9,5 e 2,3. Solo le miscele binarie di permetrina ed EO o PBO sono state testate per l'attività larvicida. La miscela EO-permetrina ha avuto un effetto antagonista, mentre la miscela PBO-permetrina ha avuto un effetto sinergico contro le larve di Aedes aegypti. Tuttavia, esperimenti dose-risposta e valutazione SR per le miscele PBO-permetrina non sono ancora stati eseguiti. Sebbene siano stati ottenuti pochi risultati riguardo agli effetti sinergici delle combinazioni fitosintetiche contro i vettori di zanzare, questi dati supportano i risultati esistenti, aprendo la prospettiva di aggiungere sinergici non solo per ridurre la dose applicata, ma anche per aumentare l'efficacia letale contro gli insetti. Inoltre, i risultati di questo studio hanno dimostrato per la prima volta che gli oli di C. rotundus e A. galanga esercitano sinergicamente un'efficacia significativamente maggiore contro i ceppi di zanzare Aedes sensibili e resistenti ai piretroidi rispetto al placebo, se combinati con la permetrina. Tuttavia, risultati inaspettati dall'analisi sinergica hanno mostrato che l'olio di C. verum ha avuto la maggiore attività anti-adulti contro entrambi i ceppi di Aedes. Sorprendentemente, l'effetto tossico della permetrina su Aedes aegypti è risultato insoddisfacente. Le variazioni negli effetti tossici e sinergici possono essere in parte dovute all'esposizione a diversi tipi e livelli di componenti bioattivi in questi oli.
Nonostante gli sforzi per comprendere come migliorare l'efficienza, i meccanismi sinergici rimangono poco chiari. Possibili ragioni per la diversa efficacia e il potenziale sinergico possono includere differenze nella composizione chimica dei prodotti testati e differenze nella suscettibilità delle zanzare associate allo stato di resistenza e allo sviluppo. Esistono differenze tra i componenti principali e secondari dell'ossido di etilene testati in questo studio, e alcuni di questi composti hanno dimostrato di avere effetti repellenti e tossici contro una varietà di parassiti e vettori di malattie [61,62,64,67,68]. Tuttavia, i principali composti caratterizzati negli oli di C. rotundus, A. galanga e C. verum, come il ciperno, il β-bisabolene e la cinnamaldeide, non sono stati testati in questo articolo per le loro attività anti-adulto e sinergiche contro Ae., rispettivamente. Aedes aegypti. Pertanto, sono necessari studi futuri per isolare i principi attivi presenti in ciascun olio essenziale e chiarire la loro efficacia insetticida e le interazioni sinergiche contro questo vettore di zanzare. In generale, l'attività insetticida dipende dall'azione e dalla reazione tra i veleni e i tessuti degli insetti, che può essere semplificata e suddivisa in tre fasi: penetrazione nella pelle del corpo dell'insetto e nelle membrane degli organi bersaglio, attivazione (= interazione con il bersaglio) e detossificazione delle sostanze tossiche [57, 69]. Pertanto, il sinergismo degli insetticidi che si traduce in una maggiore efficacia delle combinazioni di tossici richiede almeno una di queste categorie, come una maggiore penetrazione, una maggiore attivazione dei composti accumulati o una minore riduzione della detossificazione del principio attivo del pesticida. Ad esempio, la tolleranza energetica ritarda la penetrazione della cuticola attraverso una cuticola ispessita e la resistenza biochimica, come il metabolismo potenziato dell'insetticida osservato in alcuni ceppi di insetti resistenti [70, 71]. La significativa efficacia degli EO nell'aumentare la tossicità della permetrina, in particolare contro PMD-R, può indicare una soluzione al problema della resistenza agli insetticidi interagendo con i meccanismi di resistenza [57, 69, 70, 71]. Tong e Blomquist [35] hanno supportato i risultati di questo studio dimostrando un'interazione sinergica tra EO e pesticidi sintetici. aegypti, vi sono prove di attività inibitoria contro gli enzimi detossificanti, tra cui le monoossigenasi del citocromo P450 e le carbossilesterasi, che sono strettamente associate allo sviluppo di resistenza ai pesticidi tradizionali. Si dice che il PBO non sia solo un inibitore metabolico della monoossigenasi del citocromo P450, ma che migliori anche la penetrazione degli insetticidi, come dimostrato dal suo utilizzo come controllo positivo in studi sinergici [35, 72]. È interessante notare che l'1,8-cineolo, uno dei componenti importanti presenti nell'olio di galanga, è noto per i suoi effetti tossici sulle specie di insetti [22, 63, 73] ed è stato segnalato che ha effetti sinergici in diverse aree di ricerca sull'attività biologica [74]. ,75,76,77]. Inoltre, l'1,8-cineolo in combinazione con vari farmaci tra cui la curcumina [78], il 5-fluorouracile [79], l'acido mefenamico [80] e la zidovudina [81] ha anche un effetto di promozione della permeazione in vitro. Pertanto, il possibile ruolo dell'1,8-cineolo nell'azione insetticida sinergica non è solo come ingrediente attivo ma anche come potenziatore della penetrazione. A causa del maggiore sinergismo con la permetrina, specialmente contro PMD-R, gli effetti sinergici dell'olio di galanga e dell'olio di tricosantes osservati in questo studio potrebbero derivare da interazioni con meccanismi di resistenza, ovvero una maggiore permeabilità al cloro. I piretroidi aumentano l'attivazione dei composti accumulati e inibiscono gli enzimi detossificanti come le monoossigenasi del citocromo P450 e le carbossilesterasi. Tuttavia, questi aspetti richiedono ulteriori studi per chiarire il ruolo specifico dell'EO e dei suoi composti isolati (da soli o in combinazione) nei meccanismi sinergici.
Nel 1977, sono stati segnalati livelli crescenti di resistenza alla permetrina nelle principali popolazioni di vettori in Thailandia e, nei decenni successivi, l'uso della permetrina è stato ampiamente sostituito da altri piretroidi, in particolare quelli sostituiti dalla deltametrina [82]. Tuttavia, la resistenza dei vettori alla deltametrina e ad altre classi di insetticidi è estremamente comune in tutto il paese a causa dell'uso eccessivo e persistente [14, 17, 83, 84, 85, 86]. Per combattere questo problema, si raccomanda di ruotare o riutilizzare i pesticidi scartati che in precedenza erano efficaci e meno tossici per i mammiferi, come la permetrina. Attualmente, sebbene l'uso della permetrina sia stato ridotto nei recenti programmi governativi nazionali di controllo delle zanzare, la resistenza alla permetrina può ancora essere riscontrata nelle popolazioni di zanzare. Ciò può essere dovuto all'esposizione delle zanzare ai prodotti commerciali per il controllo dei parassiti domestici, che consistono principalmente in permetrina e altri piretroidi [14, 17]. Pertanto, il riutilizzo efficace della permetrina richiede lo sviluppo e l'implementazione di strategie per ridurre la resistenza dei vettori. Sebbene nessuno degli oli essenziali testati singolarmente in questo studio sia risultato efficace quanto la permetrina, la loro azione combinata con la permetrina ha prodotto effetti sinergici notevoli. Questa è un'indicazione promettente del fatto che l'interazione degli oli essenziali con i meccanismi di resistenza si traduce in una combinazione di permetrina ed oli essenziali più efficace dell'insetticida o degli oli essenziali da soli, in particolare contro Ae. Aedes aegypti PMD-R. I benefici delle miscele sinergiche nell'aumentare l'efficacia, nonostante l'uso di dosi inferiori per il controllo dei vettori, possono portare a una migliore gestione della resistenza e a una riduzione dei costi [33, 87]. Da questi risultati, è incoraggiante notare che gli oli essenziali di A. galanga e C. rotundus sono risultati significativamente più efficaci del PBO nel potenziare la tossicità della permetrina sia nei ceppi MCM-S che PMD-R e rappresentano una potenziale alternativa ai tradizionali coadiuvanti ergogenici.
Gli oli essenziali selezionati hanno mostrato significativi effetti sinergici nell'aumentare la tossicità degli adulti contro Ae. aegypti PMD-R, in particolare l'olio di galanga, che ha un valore SR fino a 1233,33, indicando che l'olio essenziale ha ampie potenzialità come sinergizzante nel migliorare l'efficacia della permetrina. Ciò potrebbe stimolare l'uso di un nuovo prodotto naturale attivo, che insieme potrebbe aumentare l'uso di prodotti per il controllo delle zanzare altamente efficaci. Rivela inoltre il potenziale dell'ossido di etilene come sinergizzante alternativo per migliorare efficacemente gli insetticidi più vecchi o tradizionali e affrontare i problemi di resistenza esistenti nelle popolazioni di zanzare. L'utilizzo di piante facilmente reperibili nei programmi di controllo delle zanzare non solo riduce la dipendenza da materiali importati e costosi, ma stimola anche gli sforzi locali per rafforzare i sistemi di salute pubblica.
Questi risultati dimostrano chiaramente il significativo effetto sinergico prodotto dalla combinazione di ossido di etilene e permetrina. I risultati evidenziano il potenziale dell'ossido di etilene come sinergizzante vegetale nel controllo delle zanzare, aumentando l'efficacia della permetrina contro questi insetti, soprattutto nelle popolazioni resistenti. Gli sviluppi e le ricerche future richiederanno un'analisi biologica sinergica degli oli di galanga e di alpinia e dei loro composti isolati, combinazioni di insetticidi di origine naturale o sintetica contro diverse specie e stadi di sviluppo delle zanzare, e test di tossicità su organismi non bersaglio. L'utilizzo pratico dell'ossido di etilene come valido sinergizzante alternativo rappresenta un'ulteriore opportunità.
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Data di pubblicazione: 08-lug-2024
